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猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征及其它相关疾病的病原。本研究应用基因工程技术构建了表达猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(porcine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、PCV2衣壳蛋白(capsid protein,CP)及共表达CP和GM-CSF的重组质粒,分析了表达PCV2 CP的重组质粒在小鼠和猪诱导的体液和细胞免疫反应,以及表达猪GM-CSF和IL-2的重组质粒对PC2 DNA疫苗免疫效果的调节作用。 采用RT-PCR方法从猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出猪GM-CSF的cDNA,构建了真核重组表达质粒pcDNA3.1-gm-csf;用PCR技术扩增出编码PCV2 CP的ORF2基因,构建了重组质粒pcDNA3.1-orf2、pcDNA4-orf2,以及共表达PCV2 CP和猪GM-CSF的重组质粒pIRES-orf2/gm-csf。采用间接免疫荧光试验和集落刺激形成试验证明,在COS7细胞中pcDNA3.1-gm-csf可表达GM-CSF,pcDNA3.1-orf2和pcDNA4-orf2可表达PCV2 CP,pIRES-orf2/gm-csf能同时表达PCV2 CP和GM-CSF。 用重组质粒pcDNA3.1-orf2和pcDNA4-orf2免疫小鼠,分析了免疫小鼠的体液与细胞免疫应答水平。结果表明,经3次肌肉注射后pcDNA3.1-orf2免疫组中80%的小鼠血清特异性抗体转阳,pcDNA4-orf2免疫组中100%的小鼠血清特异性抗体转阳;与对照组相比,pcDNA3.1-orf2免疫组小鼠脾细胞对丝裂原ConA或重组PCV2 CP的刺激反应显著增强,CTL和NK细胞的杀伤活性明显提高;pcDNA4-orf2诱导的细胞免疫反应水平低于pcDNA3.1-orf2;重组质粒免疫小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+CD4+CD8-细胞亚群和CD3+CD4-CD8+细胞亚群的百分含量提高。此外,发现肌肉注射和鼻腔接种pcDNA3.1-orf2后诱导的免疫反应没有显著差异。 将7日龄健康仔猪分成5组,分别为空载体(Ⅰ组)、pcDNA3.1-orf2(Ⅱ组)、pcDNA3.1-orf2+pcDNA3.1-gm-csf(Ⅲ组)、pIRES-orf2/gm-csf(Ⅳ组)、pcDNA3.1-orf2+pcDNA3.1-IL-2(Ⅴ组),每组3头,共肌肉注射3次,每次间隔2周。结果表明,各重组质粒免疫组均产生了低滴度的PCV2特异性ELISA抗体和中和抗体,平均中和抗体滴度分别为1:6.7,1:29.3,1:26.7,1:20.2;Ⅳ和Ⅴ组免疫猪外周血淋巴细胞的增殖活性高于Ⅱ组和Ⅲ组;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组免疫猪外周血NK细胞杀伤活性高于Ⅱ组;重组质粒免疫各组的外周血中Th、Tc和m/aTh含量显著高于空载体对照组,其中Ⅴ组的TC含量最高;重组质粒免疫各组的IL-4水平高于空载体对照组,Ⅳ和Ⅴ组IL-12表达水平显著高于Ⅱ和Ⅲ组。第3次免疫后4周经口腔和鼻腔途径接种PCV2 BJ-HB株组织毒。结果表明,各重组质粒免疫组均无体温升高,而且鼻腔和直肠的排毒率和病毒血症阳性率显著低于空载体组,以Ⅴ组的排毒率和病毒血症阳性率最低;经免疫组化和PCR检测结果表明,Ⅴ组的含毒组织检出率最低。由此表明,混合质粒pcDNA3.1-orf2+pcDNA3.1-IL-2(Ⅴ组)的免疫保护效果优于其它重组质粒,重组质粒pcDNA3.1-IL-2可显著改善重组质粒pcDNA3.1-orf2诱导的免疫反应和保护性反应;GM-CSF基因能够增强pcDNA3.1-orf2诱导的体液免疫反应。