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研究背景与目的:S100蛋白家族是一类具有EF手型结构的钙结合蛋白,能与钙离子及其靶蛋白结合并发挥多种生理功能,参与细胞增殖和分化、钙稳态、蛋白质磷酸化、酶活性和转录因子的调节等。到目前为止,至少有25种蛋白被确定为S100蛋白家族的成员,其中有21种定位于染色体1q21,该区段染色体稳定性较差,易发生多种染色体重排,与肿瘤关系密切;S100A6的基因也位于此,同时它在多种肿瘤中高表达,提示其与肿瘤密切相关,但它与肿瘤发生发展的确切关系尚不明确。Wnt/β-catenin信号失调与肿瘤的发生发展密切相关,其活性升高也常常存在于许多肿瘤中;β-catenin是该信号途径的关键分子。在多种肿瘤中,β-catenin的高表达还常常与S100A6的高表达同时存在,但是两者之间的具体关系尚不明了。本研究拟探讨hS100A6对小鼠黑色素瘤细胞株(B16)、人卵巢癌细胞株(低转移株HO8910和高转移株HO8910 PM)、人结肠癌细胞株(HCT116和SW480)和人骨肉瘤细胞株(MG63和U2OS)细胞的增殖、凋亡及对细胞中Wnt/β-catenin信号途径的影响,为阐明S100A6在肿瘤发生发展中的作用、S100A6对Wnt/β-catenin信号途径的作用提供实验依据。方法:1.重组hS100A6的制备:用氯化钙法将已经构建的pGST-moluc和pGST-moluc-hS100A6质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21;用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达;冰上超声裂解细菌后,用谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(Glutathione Sepharose 4B beads)从细菌裂解液中分离纯化GST和GST-hS100A6,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Quantity One软件鉴定和分析纯化效果,Western-blot法鉴定重组蛋白,BCA方法进行蛋白定量,分装后-80℃保存备用。2.用不同浓度的GST-hS100A6干预所选的各个细胞株,MTT法检测hS100A6对各细胞株增殖的影响。3.根据上一部分试验结果,选取一个合适的蛋白浓度,用GST-hS100A6干预各细胞株,台盼蓝染色活细胞计数法检测hS100A6对细胞增殖作用的时间依赖性。4. Western blot、免疫细胞化学法及免疫荧光法检测检测hS100A6干预后各肿瘤细胞中β-catenin的表达水平及分布变化。5. pTOP-LUC转染各肿瘤细胞株后,用GST-hS100A6处理细胞,通过荧光素酶活性分析探讨hS100A6对Wnt/β-catenin信号途径活性的影响。6.用免疫细胞化学法检测用GST-hS100A6干预后各肿瘤细胞中Wnt/β-catenin信号途径下游靶基因c-myc表达量的变化。结果:1. XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切pGST-moluc-hS100A6后,出现300 bP左右的目的片段,与其限制性内切图谱相符;诱导表达、分离纯化后的重组蛋白其纯度达92%,经过Western blot鉴定,出现S100A6的特异性阳性反应条带。表明该表达质粒构建正确,能诱导表达出GST-hS100A6;BCA法蛋白定量,并计算该重组蛋白的获率分别为5.67 mg/L菌液;GST为对照蛋白。2. hS100A6能够抑制这七株肿瘤细胞的增殖,并呈一定的浓度依赖性。以B16细胞为例:GST-hS100A6处理72 h,3μg/ml和10μg/ml组的OD值与相应浓度的GST组无显著差异(P>0.05),而30、100、300μg/ml和1000μg/ml组的OD值分别较相应浓度的GST组的OD值减少15%、25%、31%和33%,差异具有统计学意义(P<0.05);其他六株细胞的增殖随蛋白浓度的变化趋势与B16细胞基本一致。3. hS100A6对肿瘤细胞增殖的抑制作用呈一定程度的时间依赖性。例如GST-S100A6处理的HO8910 PM组的活细胞数在前2 d与GST组的差异无统计学意义(P>0.05),第3、4和5 d的活细胞数分别是GST组的71.4%、68.0%和63.7%,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。其它六株细胞的增殖随处理时间的变化趋势与HO8910细胞基本一致。4. hS100A6致本实验中七株肿瘤细胞的凋亡率增加1.43-4.3倍,差异具有统计学意义(P<0.01)。例如:重组hS100A6作用于HO8910细胞后细胞凋亡率比GST组增加3.33倍,差异具有统计学意义(P<0.01)。5. Western blot法测得AdS100A6作用于本实验中的七株肿瘤细胞72 h后,细胞β-catenin水平增加36.7%-52.1%(P<0.01)。例如:AdS100A6处理72 h的B16细胞中β-catenin的校正灰度值较相应的AdGFP组增加43.9%,差异具有统计学意义(P<0.01);AdGFP组和空白对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。6.免疫细胞化学测得hS100A6作用于本实验中的七株肿瘤细胞后,细胞β-catenin不仅表达量分别增加23.8%-52.7%,且有核移位倾向。例如:在未处理的B16细胞中,β-catenin主要在胞浆及核膜上表达,核内表达较少;GST-hS100A6干预72 h后的B16细胞染色普遍加深,其平均光密度值较GST组增加23.7%(P<0.01);同时,核内的表达增加较胞浆更为明显。提示, hS100A6使肿瘤细胞内β-catenin的表达普遍增加,甚至可促进其进入核内。7.免疫荧光法测得B16、U2OS和MG63细胞经GST-hS100A6处理后细胞内β-catenin的总量增加,并使其在细胞浆内聚积而进入细胞核,与免疫细胞化学的结果一致。例如:未处理的U2OS细胞内的β-catenin主要位于胞浆内和核膜,细胞核内β-catenin表达较少;GST-hS100A6处理后的U2OS细胞内荧光强度明显高于GST组,胞浆及胞核荧光着色均增强。8.荧光素酶活性分析法测得经GST-hS100A6处理后本实验中的七个肿瘤细胞株的β-catenin/TCF4转录活性升高6.4-14.3倍。例如:转染pFOP-LUC的SW480细胞的GST-hS100A6组与GST组及空白对照组差异无统计学意义(P>0.05),转染pTOP-LUC的SW480细胞的GST-hS100A6组的荧光素酶活性是相应GST组的6.5倍,差异具有统计学意义(P<0.01)。提示:S100A6能够特异上调这些细胞中的β-catenin/TCF4转录活性。9.免疫细胞化学法测得HO8910、MG63和HCT116细胞经GST-hS100A6干预72 h后细胞内c-myc的表达分别增加105.6%、75.7%和92.6%,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:1. pGST-moluc-hS100A6在大肠杆菌BL21中有效表达出可溶性重组蛋白GST-hS100A6;经谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠分离纯化后,其纯度达92%,并有生物学活性,1L菌液中获得约5.67 mg蛋白。2. S100A6能够明显抑制实验所选的七株肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡,并呈一定的浓度和时间依赖性。3. S100A6能够增加这些肿瘤细胞内β-catenin的水平,使其在细胞浆中聚集和进入细胞核,从而增强细胞内Wnt/β-catenin信号途径的转录活性,导致下游靶基因c-myc等的表达增加。因此, S100A6可能是导致肿瘤细胞中Wnt/β-catenin信号途径活性增强的潜在机制。4. S100A6对肿瘤细胞具有复杂的生物学作用:例如,能够抑制肿瘤细胞增殖的同时也能增加细胞中Wnt/β-catenin途径活性;各相关效应之间相互协同和/或相互拮抗,由此实现S100A6对肿瘤细胞的精细调控,并决定在细胞水平上的最后效应。