论文部分内容阅读
养殖生产上,仔猪由于断奶时期的心理和环境因素会产生强烈应激,在断奶后一周内尤为严重,常常导致腹泻等“断奶后应激综合征”。肝脏是最容易受到应激损伤的器官之一,研究发现,断奶应激会导致仔猪肝脏出现严重的氧化应激损伤和细胞凋亡现象。肝脏是养分吸收代谢的重要场所,目前在仔猪断奶应激方面的研究大多集中在肠道损伤,对肝脏功能损伤的研究较少。研究发现抗菌肽能够通过宿主免疫调节缓解肝脏炎症、提高抗氧化能力等保护人类或小鼠肝脏的健康。人工设计改良的新型抗菌肽更是弥补了天然抗菌肽的不足之处。本课题组前期研究发现人工设计的新型α螺旋抗菌肽KR-32在体外有良好的杀菌和抗病毒作用,同时在体内能够有效缓解断奶仔猪肠道脂肪酸吸收障碍,提高仔猪生长性能,但其对肝脏功能的影响还尚未见报道,因此,本研究聚焦在抗菌肽KR-32对于断奶仔猪腹泻和肝脏功能的影响上,并通过建立LPS诱导的小鼠肝损伤模型对抗菌肽KR-32调控肝脏脂质代谢功能的作用机制进行了初步探究。研究的具体内容和结果如下:1.抗菌肽KR-32对断奶仔猪腹泻、炎症、脂质代谢与肝功能指标的影响选取12头断奶7天（21天断奶）体重相近的杜长大腹泻仔猪,平均随机分为对照组和抗菌肽KR-32组两组,每组6头。抗菌肽KR-32组每头仔猪每天腹腔注射1次5mg抗菌肽KR-32,对照组注射同等体积的生理盐水。治疗处理时间为连续3天。研究结果发现:抗菌肽KR-32在缓解仔猪腹泻方面,抗菌肽KR-32组的腹泻仔猪在注射抗菌肽KR-32治疗的过程中,腹泻率和腹泻指数均呈现逐渐下降的趋势,治疗3天后腹泻率下降到20%以下,腹泻指数降低到0.5以下,显著低于对照组仔猪,结果说明,腹腔注射抗菌肽KR-32可缓解断奶仔猪腹泻症状;抗菌肽KR-32在缓解仔猪炎症方面,与对照组相比,注射抗菌肽KR-32治疗的腹泻仔猪血清中促炎细胞因子的含量显著降低（P<0.05）,结果提示抗菌肽KR-32可能通过降低血清促炎因子白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-8（IL-8）的含量缓解腹泻仔猪机体炎症反应;抗菌肽KR-32对腹泻仔猪脂质代谢和肝功能相关指标的影响方面,抗菌肽KR-32组仔猪与对照组腹泻仔猪相比,血清甘油三酯、总胆汁酸、白蛋白含量显著升高（P<0.05）,血清总胆固醇、总蛋白、球蛋白含量显著降低（P<0.05）,血清总胆红素含量差异不显著,血清肝功能指标谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、谷氨酰转肽酶（Glutamyl transpeptidase,GGT）的含量显著降低（P<0.05）,提示仔猪断奶应激腹泻可能会造成机体脂质代谢紊乱,肝脏出现损伤,抗菌肽KR-32可缓解肝功能损伤。本部分试验结果说明,抗菌肽KR-32能够缓解仔猪断奶应激腹泻及炎症,同时维持肝脏功能及机体脂质代谢的稳定。2.抗菌肽KR-32对LPS诱导的小鼠肝脏病理损伤和脂质代谢功能紊乱的影响。进一步探究抗菌肽KR-32对肝脏脂质代谢功能的影响,包括其对肝脏病理损伤、炎症及脂质代谢功能的调控。36只6周龄C57BL/6小鼠,平均分为三组（Control组,LPS 组,LPS+KR-32组）,LPS组和LPS+KR-32 组腹腔注射 LPS,Control 组注射PBS缓冲液,处理2天后,LPS+KR-32组腹腔注射抗菌肽KR-32,Control组注射PBS缓冲液,处理3天,试验结束给小鼠灌胃橄榄油比较肝脏脂质代谢差异。研究结果发现:抗菌肽KR-32对肝脏病理损伤的影响方面,KR-32能够显著降低由LPS诱导的肝脏指数的增加（P<0.05）,H&E染色显示,LPS会导致小鼠肝脏组织结构病变化,抗菌肽KR-32处理后肝细胞形态结构明显好转,同时与LPS组相比,抗菌肽KR-32能够显著降低血清中肝功能指标ALT和AST的含量（P<0.05）;抗菌肽KR-32在缓解肝脏炎症方面,与对照组相比,LPS组小鼠肝脏组织中促炎因子IL-6、白介素-1β（IL-1β）、TNF-α、单核细胞趋化因子-1（MCP-1）的表达量显著高于对照组和抗菌肽KR-32治疗组（P<0.05）,LPS组抑炎因子白介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）的含量显著低于抗菌肽KR-32组（P<0.05）,以上结果说明,抗菌肽KR-32 可能通过调控肝脏炎症因子的表达缓解肝脏炎症反应,改善病理损伤;抗菌肽 KR-32 对肝脏脂质代谢功能损伤的影响方面,小鼠肝脏组织油红 O 染色结果显示,LPS处理造成肝细胞之间脂滴异常聚集,且肝脏组织甘油三酯含量显著高于对照组（P<0.05）,LPS+KR-32组小鼠肝脏组织脂滴聚集现象明显缓解,甘油三酯含量与LPS组相比显著降低（P<0.05）,检测脂质合成相关通路,结果显示与对照组相比,LPS组小鼠肝脏脂质合成相关因子固醇调节原件结合蛋白-lc（Sterol regulatory element bindingprotein-1c,SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase,ACC）表达量显著高于对照组和LPS+KR-32组（P<0.05）,脂质氧化通路方面,LPS和LPS+KR-32组的脂肪酸氧化相关基因肉碱软脂酰转移酶（cpt1α）、细胞色素P450酶4A10（cyp4α10）、细胞色素P450酶4A14（cyp4α14）的表达量相比于对照组显著下降（P<0.05）,与LPS组相比,LPS+KR-32组脂质氧化相关转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPAR-α）的表达量显著升高,脂质转运通路方面,过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）和脂肪酸转运蛋白（CD36）的蛋白表达量结果显示无差异,提示本试验可能是通过激活PPAR-α 而并未激活 PPAR-γ—CD-36 通路来提高肝脏脂质的利用。以上结果说明 LPS 可能是通过上调脂质合成通路SREBP-1c—FAS/ACC,同时下调PPAR-α—cpt1α/cyp4α10/cyp4α14脂质氧化通路导致脂质利用受阻,造成肝脏出现脂滴堆积现象,抗菌肽KR-32通过下调SREBP-1c—FAS/ACC通路减少脂质合成,同时激活PPAR-α增加脂质氧化,从而缓解肝脏的脂滴聚集现象。综上所述,新型抗菌肽KR-32能够有效缓解仔猪断奶应激造成的腹泻、炎症、肝功能损伤等症状,促进断奶仔猪健康。通过小鼠试验验证抗菌肽能够缓解LPS诱导的小鼠肝脏病理损伤和脂质代谢紊乱,并初步发现其可能是通过调控SREBP-1c—FAS/ACC和PPAR-α的脂质代谢通路来发挥作用,本研究为推进抗菌肽KR-32在养殖生产中促进肝脏功能健康及缓解仔猪断奶应激方面的应用提供了基础。