背景人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一组可引发人类上皮细胞发生增殖反应的环状DNA病毒。HPV感染可以引起皮肤粘膜的良性增生性病变甚至发生恶性肿瘤。由于感染局部的免疫缺陷以及缺乏有效的特异性抗病毒制剂和彻底根治的物理方法,使感染迁延不愈。近年来随着加温、测温和控温技术的不断发展和完善,以及有关热疗的生理学和病理生理学的研究逐步深入,热疗得到了迅速发展。有学者将局部温热用于病毒疣的治疗,取得了一定的效果,而且局部温热疗法无创伤,痛苦小,复发率低,患者易于接受,有可能成为一种简捷、常规、有效的治疗手段。造成HPV持续感染的可能原因是机体不能建立有效的免疫反应及机体的免疫监视功能障碍。朗格汉斯细胞(Langerhans cell,LC)为树突状细胞系统中的一种独特类型,作为皮肤及黏膜的抗原提呈细胞,在摄取、加工和处理抗原的过程中,同时发生形态学变化,并逐渐离开表皮,移行至引流淋巴结,将抗原递呈给T辅助细胞,在协同刺激信号的作用下使之活化,从而启动免疫应答,因此在免疫系统中起着重要作用。HPV进入人体后常形成持续感染,其原因在于局部的免疫抑制和/或不能识别病毒蛋白,导致免疫逃逸。在HPV感染的皮肤组织中,LC有充足的机会接触HPV抗原,单独的抗原和或淋巴细胞并不能激活机体的免疫功能,只有在抗原提呈细胞的作用下,多方面因素相结合,才能激发机体的免疫应答。LC作为迄今为止所发现的功能最强大、表皮内分布最广泛的抗原提呈细胞,对其在温热治疗病毒疣治疗的发病机制中作用研究就显得非常必要。本研究中,我们通过检测:①不同温热对LC数量和形态的影响;②不同温热对朗格汉斯细胞游走及成熟功能的影响;③温热对LC信号传导功能的影响。以说明温热对促进LC有效诱发免疫应答中的作用,为病毒疣的温热治疗提供可靠的依据和指导。材料和方法一、材料临床资料:女性尖锐湿疣(Condyloma acuminatum,CA)患者均为我院皮肤科、妇科科2006年1月-2008年2月的门诊患者,符合2000年卫生部防疫司制订的CA诊断标准。均为初发患者,未经过任何治疗。对照组:对照为同时期我院急诊外伤缝合的非CA患者。二、方法(一)取材:1、征得患者知情同意后,局部消毒麻醉,分别切取疣体/正常组织,每例组织等分为4份。其中一份OTC包埋剂包埋后直接冷冻保存,另3份真皮侧向下,放入少量RPMI-1640培养液,只将疣体底部浸于培养液中分别以37℃、42℃和45℃三个温度照射30分钟后,将疣体取出,OCT包埋剂包埋后冷冻保存。2、征得患者知情同意后,局部消毒麻醉,切取疣体/正常组织各,每例组织用以上相同方法处理后,将疣体全部浸于RPMI-1640培养液,37℃培养箱孵育12小时后将组织取出,OCT包埋剂包埋后冷冻保存,同时收集培养液中的细胞。(二)温热对表皮内LC数量和形态的影响采用免疫组化方法对20例CA患者和20例正常人表皮内LC染色,高倍光学显微镜下观察不同温热处理后LC数目和形态变化。(三)采用直接免疫荧光方法,用CD1a、CD83单克隆抗体标记LC,利用共聚焦显微镜观察未经过任何处理CA和正常皮肤组织CD1a~+,CD83~+LC的分布。(四)通过流式细胞分析仪检测CA/正常人不同温热处理后CD1a~+,CD83~+LC细胞百分率。观察不同温热治疗后LC成熟标志—CD83的变化。(五)采用QRT-PCR方法检测不同温热治疗对LC表面趋化因子受体CCR6和CCR7 mRNA的表达变化。(六)采用QRT-PCR方法检测不同温热治疗对LC信号传导分子—PI3-KmRNA的表达变化。(七)统计学方法:采用SPSS13.0版本软件对资料进行统计学分析。测得结果用(?)±s表示,采用区组方差分析、t检验统计方法。P＜0.05有统计学意义。结果一、温热治疗后皮肤组织内LC数量和形态的变化1、温热治疗后CA和正常人表皮内LC的数量变化:不同温热治疗后,随温度升高,LC数量逐渐减少,经统计学处理,差异具有显著性(P＜0.01);CA组织比正常组织表皮内LC减少更明显,也随温度变化而变化。正常人和CA组织相同温度之间的LC数量经统计学处理,也具有显著性差异(P＜0.01)。2、不同温热治疗后表皮内LC的形态变化不同温热治疗后,LC减少、变短或消失,具有温度相关性。CA组织较正常组织变化更明显。二、我们采用免疫荧光方法,用CD1a、CD83单克隆抗体双标记正常皮肤组织和疣组织,发现多数LC位于表皮,而且只表达CD1a,不表达CD83。三、不同温热条件对LC游走的影响:正常皮肤组织和疣组织经不同温度处理,并孵育12小时后,培养液中有较多的游走细胞。本研究采用双色色标记法,检测了游走至培养液中CD1a,CD83阳性细胞的百分数。经37℃,42℃和45℃处理后游走至培养液中LC的比例不同。随温度升高,CD1a~+,CD83~+LC百分比逐渐增加。四、为进一步证明温热对LC成熟功能的影响,我们采用荧光实时定量PCR的方法检测趋化因子受体CCR6和CCR7 mRNA水平变化。正常皮肤组织、疣体组织经不同温热条件处理后,游走至培养液中LC趋化因子受体mRNA表达比率不同;同一组织利用不同温度处理后,CCR6mRNA的表达量随温度增加逐渐减少,而CCR7mRNA的表达量随温度增加逐渐增加。五、温热对LC信号传导功能的影响本研究采用RT-PCR方法检测游走纯化的LC发现PI3Kp110αmRNA表达量随温度升高而逐渐增加。而未经过处理的疣组织的表达量低于正常皮肤组织。结论1、局部温热治疗后皮损部位LC较正常组织LC数量和结构均发生了明显改变,推测温热能促进LC离开表皮,通过真皮向局部淋巴结迁移,促进局部细胞免疫应答反应。2、局部温热治疗后游走至培养液中的LC明显增多,而且随温度升高CD83~+LC逐渐增多,CCR7 mRNA表达量也逐渐增多,说明温热能够促进LC成熟,温热能够促进LC的迁移和增强抗原提呈能力,LC通过真皮向局部淋巴结迁移,在局部细胞免疫应答中发挥作用。温热能够有效治疗HPV感染皮肤病,是协助增强了机体免疫系统的作用。3、温热可能通过抑制HPV感染皮肤LC PI3-K的活性,调控信号传导通路。