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奶牛是畜牧养殖业中的重要经济动物之一,奶牛的乳产量和乳品质是衡量养殖水平和经济效益的重要标准。我国虽是世界奶牛养殖大国,但奶牛的年平均单产低于世界平均水平。乳脂率和乳蛋白含量也相对较低,严重影响消费者的消费需求。乳是由乳腺自身合成和分泌的,乳腺发育及泌乳过程中重要功能基因的表达变化是调节乳腺生长、发育、分化以及乳汁合成、分泌、转运等重要生理过程的基础。因此,对乳腺发育和泌乳重要功能基因的筛选及功能鉴定对奶牛遗传性能的改善、促进我国奶业的发展有积极作用。奶牛乳腺在泌乳期是乳汁合成和分泌旺盛时期,受多种基因协同调节。为揭示奶牛乳腺在泌乳期相对于其他发育时期差异表达基因,本实验采用Affymetrix公司的牛基因组表达谱芯片对荷斯坦奶牛不同发育时期差异表达的基因进行筛选,并通过泌乳期同青春期、妊娠期和干乳期奶牛乳腺组织中基因表达情况的对比,获得泌乳期奶牛乳腺基因表达谱,同时使用荧光定量RT-PCR技术对芯片结果进行验证。结果显示,泌乳期与青春期、妊娠期及干乳期奶牛乳腺对比,共筛选出差异表达基因567个,其中泌乳期高表达基因163个,泌乳期低表达基因404个。荧光定量RT-PCR方法对芯片结果进行验证也显示出与芯片结果的一致性,表明通过基因芯片技术筛选奶牛泌乳期差异表达基因结果准确,可信度高。将筛选出的泌乳期特异性表达基因在Gene Ontology数据库中检索,获得基因功能的生物学注释。结果显示:在泌乳期奶牛乳腺中高表达的基因功能很大程度上和乳腺在此阶段的生理功能相联系。泌乳期奶牛乳腺组织筛选出的主要功能基因集中在乳汁的合成和分泌上,同时也有同组织发育相关的功能基因出现。将筛选出的在泌乳期差异表达基因进行信号通路分析,得到泌乳期相对于其他各时期活跃的信号通路,有助于对泌乳期乳腺中各种分子事件进行解释。根据基因芯片结果,在泌乳期高表达基因中选取Kcnmal和Ihh基因,对其在泌乳期的调控功能进行验证。采用基因过表达技术和RNA干扰技术分别对Kcnmal和Ihh基因进行正负调控,分别增加和减少其在泌乳盛期奶牛乳腺上皮细胞中的表达,采用Western Blot和流式细胞仪检测Kcnmal和Ihh基因表达量发生变化后,乳腺上皮细胞内酪蛋白和磷酸化STAT5的表达变化,以及乳腺上皮细胞增殖活性变化。结果表明,Kcnmal基因有促进乳蛋白合成的作用(P＜0.05),Kcnmal基因还具有促进细胞增殖的作用(P＜0.05)。Ihh基因对乳腺上皮细胞酪蛋白合成影响不显著(P＞0.05),对细胞增殖影响不显著(P＞0.05)。