论文部分内容阅读
3-羟基丙酸(3-HP)含有羧基和羟基两种官能团,化学性质较为活泼,在工业上能合成许多重要的化合物。因此,针对目前甘油产量过剩且价格不断走低的现状,构建甘油转化合成3-羟基丙酸的基因工程菌成为各国学者的研究热点。本课题以实验室构建的重组大肠杆菌E.coli W3110_△glpR(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB)为研究对象,优化了重组菌摇瓶培养的基本条件,考察了该菌株采用静息细胞生物转化生产3-羟基丙酸的能力,并进一步在发酵罐中优化了甘油发酵合成3-羟基丙酸的工艺条件。主要结果如下:(1)在摇瓶中采用单因素实验对重组大肠杆菌的发酵条件进行了优化,获得最优培养基配方:甘油30g/L,葡萄糖20 g/L,NaCl 1 g/L,MgSO4·7H2O 0.25 g/L,Na2HPO4·12H2O 22.7 g/L,KH2PO4 3g/L,酵母膏4g/L,(NH4)23O4 4g/L,VB12 5 mg/L,初始pH7.0。种子液培养时间为10 h,接种量4%(V/V),IPTG添加量为0.05 mM,诱导温度为30℃。在上述条件下,3-羟基丙酸发酵产量为5.19 g/L,比优化前提高了 2.08倍。(2)考察了采用重组菌静息细胞生物转化合成3-羟基丙酸的基本条件,采用单因素实验,优化了静息细胞生物转化甘油生成3-羟基丙酸的反应体系:细胞浓度20 g/L,甘油浓度20 g/L,辅酶VB12浓度为 10 mg/L,NAD+浓度为 0.15 mM,温度 35℃和 0.05 mol/L 的Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)。反应6个小时后,3-羟基丙酸产量达到4.12 g/L,得率为0.51 g/g甘油。(3)优化了 5L发酵罐中3-羟基丙酸的发酵工艺,发酵过程中控制pH恒定7.0,3-羟基丙酸产量为7.31 g/L,比pH不控制的情况提高了 0.9倍。在pH恒定为7.0的基础上,考察了 VB12添加方式对发酵的影响。每隔12小时补加一次5 mg/L的辅酶VB12,3-羟基丙酸产量提高至8.56 g/L,比对照提高了 17%。另外,为了平衡发酵过程中的氧还原电位,在发酵液中添加了 20 g/L葡萄糖,使3-羟基丙酸产量提高至10.23 g/L。后续考察了甘油分批补加对发酵的影响,确定了最适甘油添加时机为甘油浓度下降至15 g/L时开始添加,并维持甘油浓度在15-20 g/L之间,发酵结束后3-羟基丙酸产量达12.23 g/L。而在添加葡萄糖的基础上,进行甘油补加,维持甘油浓度在15-20 g/L之间,发酵结束后3-羟基丙酸产量为15.4 g/L。