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在漫长的进化过程中，昆虫与微生物形成了密切的共生关系，其中前者为后者提供稳定的生存环境，而后者提高前者对外界的适应能力。褐飞虱Nilaparvata lugens（St(a)l）属单食性昆虫，长期取食营养（如氨基酸等）极不均衡的水稻韧皮部汁液，并对水稻造成严重的危害。生物信息学等方面的研究表明，褐飞虱体内精氨酸(Arginine，Arg，单字母简写R)等必需氨基酸的合成与利用由其体内的类酵母共生菌(Yeast-likesymbiont，YLS)参与。在此基础上，本文通过RT-PCR和RACE技术克隆了褐飞虱体内精氨酸的合成通路基因，明确了这些基因的系统进化关系，通过RNAi明确了精氨酸合成通路基因中YLS来源的编码精氨基琥珀酸裂解酶(Argininosuccinate lyase，EdArg4)的基因在褐飞虱变态发育中的作用。本文的主要研究结果如下。 1、褐飞虱精氨酸合成通路基因的克隆和序列分析 基于褐飞虱及其体内YLS的氨基酸合成途径，克隆了精氨酸合成途径的相关基因。共克隆得到16个基因，编码12种酶（氨基酸-N-乙酰基转移酶、乙酰谷氨酸激酶、N-乙酰-γ-谷酰基磷酸还原酶、乙酰鸟氨酸转氨酶、乙酰鸟氨酸脱酰酶、鸟胺酸氨甲酰基转移酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、谷氨酸5-激酶、谷氨酸-5-半醛脱氢酶、鸟氨酸转氨酶、鸟氨酸环化脱氨酶），其中褐飞虱5个基因编码3种酶（1个基因编码氨基酸-N-乙酰基转移酶，1个基因编码鸟氨酸环化脱氨酶、3个基因编码鸟氨酸转氨酶），YLS11个基因分别编码11种酶。结果表明，精氨酸合成需要8步反应，分别由氨基酸-N-乙酰基转移酶、乙酰谷氨酸激酶、N-乙酰-γ-谷酰基磷酸还原酶、乙酰鸟氨酸转氨酶、乙酰鸟氨酸脱酰酶、鸟胺酸氨甲酰基转移酶、精氨琥珀酸合成酶和精氨琥珀酸裂解酶参与。其中，褐飞虱基因组自身仅含有编码氨基酸-N-乙酰基转移酶的基因，而YLS基因组合有编码参与上述8个酶的基因。此外，对上述9个基因的系统发育分析表明，仅源于褐飞虱的基因NlNA GS(Amino-acid N-acetyltransferase，氨基酸-N-乙酰基转移酶)与已知昆虫的NAGS亲缘关系较近，而源于YLS的各基因均与已知真菌类的同源基因在系统进化树中聚为一支。由此推断，褐飞虱与YLS共同参与精氨酸的合成利用。 2、褐飞虱精氨琥珀酸裂解酶EdArg4基因的时空表达和RNAi 克隆得到了精氨琥珀酸裂解酶EdArg4全长cDNA序列，长度为1687 bp，其中开放阅读框(Open reading frame，ORF)为1401 bp，编码466个氨基酸残基，分子量约为52.3 KD。多序列比对和序列结构分析表明，EdArg4含有C1、C2和C3三个保守的结构域，系统进化分析表明，EdArg4与巴西虱蚜的YLS(Cerataphis brasiliensis YLS)的同源基因相似性达96％，并在系统进化树中与丝状真菌（Tolypocladium inflatum）和巴西虱蚜的YLS形成1个聚类群(100％自展值)。组织表达谱表明，EdArg4在褐飞虱脂肪体中的转录水平显著高于中肠、足、卵巢和表皮等组织。发育阶段表达谱表明，EdArg4在褐飞虱各个发育阶段中均表达，其中在4龄第1天的表达量最高，3龄第3天次之，2龄第2天最低。此外，与对照组相比，注射dsArg4的试虫目的基因EdArg4的表达量显著降低至20％～60％，血淋巴中游离精氨酸的含量降低50％。死亡率提高至15％～25％，若虫发育历期延长0.5～1天，处理组的成（若）虫的翅、足、触角和腹部表现畸形。与此同时，与对照组相比，处理组中精氨酸合成途径的其它基因的表达量也有不同程度的降低。 3、敲低精氨琥珀酸裂解酶EdArg4对褐飞虱一氧化氮(nitric oxide，NO)、20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)、类胰岛素多肽(insulin-like peptide，ILP)及TOR(Target of rapamycin)信号通路的影响 敲低EdArg4后，检测了褐飞虱NO、20E、ILP和TOR等4个信号通路中的关键基因的表达量。首先，与对照组相比，分别注射dsArg4-1，dsArg4-2后第6天，NlNOS-1的表达量分别升高了50％和100％，NO/cGMP通路下游基因NlcGK-1在第4天和第6天时均显著升高了20％～30％,NlvATPase-D和NlvA TPase-E在第4天和第6天时均显著下降了25％～60％。其次，敲低EdArg4后第4天，NlE75在dsArg4-2处理组中的表达量显著上调了近100％，NlHR3在两个干扰组中的表达量则显著下调了70％～90％，而NlFTZ-F1和NlPHM在dsArg4-1处理组中的表达量均显著上调了约70％。再次，敲低EdArg4-1的第2、4天，NlTor和NleIF4B和表达量均显著下调，而NlS6-2仅在dsArg4-2处理后第2天显著下降。最后，敲低EdArg4第2天，褐飞虱类胰岛素多肽NlILP1、NlILP3及其受体NlInR1和NlInR2的表达量显著下调了20％～90％。由此可见，敲低EdArg4抑制了褐飞虱NO、ILP信号通路，扰乱了TOR信号通路及20E的下游通路。上述结果为进一步研究氨基酸营养与褐飞虱生长发育间的分子作用机理提供了参考。