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碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)可促进成肌细胞和血管内皮细胞增殖,加速新生血管的形成。如何控制两者的释放时序及其剂量使其以最佳效果促进血管化肌再生成为共同探讨的主题。本文拟通过超临界流体抗溶剂法(supercritical fluid anti-solvent technology,SAS),选取丝素蛋白(silk fibroin,SF)和聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(polylactide-block-poly(ethylene glycol)-block-polylactide,PPP)为材料,构建负载bFGF和VEGF微包纳颗粒(nano-embeded microparticle,NEM),将其原位注射到小鼠肌缺损部位,研究生长因子对该部位修复情况的促进作用。期望实现bFGF和VEGF在肌缺损部位通过时序性释放行为促进血管密度增加进而加速肌缺损部位修复的目标,为解决血管化肌再生的问题提供一个思路。首先,制备丝素纳米粒(silk fibroiin nanoparticles,SF NPs)、PPP 微粒和SF/PPPNEM及其表征。Minitab全因子设计结果表明,当丝素溶液浓度为1.0%(w/v),溶液流速为0.5 mL/min,二氧化碳流量为40 g/min时,制得的SF NPs形貌和粒度分布较好,其平均粒径约为84 nm。PPP微粒和SF/PPP NEM的相关理化性能表征表明,三种粒子均为球形,且其粒径大多分布在90 nm、1.0 μm和1.5 μm附近;三种微粒表面电负性均为负值;傅里叶变换红外光谱结果显示三种微粒较原料的物化结构均没有发生改变;X-射线粉末衍射光谱结果显示,较丝素蛋白原料相比,SF NPs的α-螺旋向β-折叠转变;PPP微粒和SF/PPP NEM的衍射峰相似,较其原料相比,结晶度均有所降低解;差示扫描量热仪测定结果显示,SF NPs较原料的玻璃化温度升高,但其和PPP微粒、SF/PPP NEM的分解温度均有所降低;体外降解8周的实验结果表明,三种微粒的形貌均发生了一定程度的改变,说明SF/PPP NEM降解缓慢。其次,进行载药SF/PPP NEM的制备与表征。以牛血清白蛋白(albumin of bovine serum,BSA)为模型,构建 BSA@SF/PPP NEM 和 SF/BSA@PPPNEM,考察了不同投药量和不同载药模型项下BSA的载药量及体外释放效果。结果表明当投药量为 10%(w/w)时,BSA@SF/PPPNEM 和 SF/BSA@PPPNEM 的载药量分别为(1.56±0.17)%和(2.05±0.30)%;当投药量为20%(w/w)时,BSA@SF/PPP NEM和 SF/BSA@PPP NEM 的载药量分别为(2.03±0.44)%和(2.88±0.05)%。体外释放结果表明,SF/PPP NEM作为BSA的载体具有缓释效果,且将BSA载于PPP微米层时释放速度较其载入SF纳米层时快。再次,进行载体的体外生物相容性评价。分别考察了 SF NPs、PPP微粒和SF/PPP NEM的细胞毒性及溶血性能。结果表明载体无细胞毒性、无溶血性能,且生化指标良好;急性全身毒性结果表明,载体无内脏毒性。综上说明载体材料生物相容性良好。最后,通过SAS技术制备不同空间分布的bFGF-VEGF微包纳颗粒并进行相关动物试验。系统考察bFGF和VEGF的载药量、体外释放性能、释放液中生长因子的活性及其对小鼠成肌细胞(mouse myoblast cells,C2C12)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)相对增殖率的影响及其对造模小鼠肌缺损部位修复的促进作用。结果表明,当bFGF投药量为1.5 × 10-8(w/w)时,bFGF@SF/VEGF@PPPNEM 和 VEGF@SF/bFGF@PPPNEM 的载药量分别为(3.41±0.26)× 10-11 和(2.08±0.18)× 10-11;当 VEGF 的投药量为 0.5× 10-8(w/w)时,bFGF@SF/VEGF@PPPNEM 和 VEGF@SF/bFGF@PPPNEM 的载药量分别为(1.51±0.06)× 10-11和(2.37±0.04)× 10-11;结果显示,投药量相等时,生长因子在微米层较纳米层释放快;释放液中生长因子活性测定结果表明,释放媒介中bFGF和VEGF活性良好;bFGF-VEGF对细胞C2C12和HUVECs增殖率影响的考察结果表明,两种体系中生长因子明显促进了 C2C12和HUVECs 的增殖,但VEGF@SF/bFGF@PPP NEM 的效果更好。将bFGF@SF/VEGF@PPP NEM 和 VEGF@SF/bFGF@PPP NEM 原位注射到肌缺损模型鼠体内,H&E染色结果表明,后者考察组内小鼠缺损肌肉处恢复良好,表明bFGF和VEGF的时序性释放发挥较好的促修复作用。综上所述,采用SAS技术可构建不同空间分布的bFGF-VEGF微包纳颗粒,形貌规则、粒度均一;模型蛋白BSA的体外释放行为为生长因子释放行为的研究提供了参考,表明该递送系统具有时序释放特点;载体具有较好的生物相容性;bFGF和VEGF可以促进小鼠肌缺损部位的修复。本课题研究有望为解决临床血管化肌再生的问题提供一个思路。