【摘 要】
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苹果(Malus domestica Borkh.)是世界四大水果之一,也是我国最重要的果树种类。黄土高原地区不利的环境因素和苹果花芽形成难等问题制约着该地区苹果产业的发展。性状优良的砧木能够改善品种的生长和抗逆性能。植物激素在调控苹果成花等生长发育过程,以及应对不利环境的响应中具有重要作用。据报道,KNOX(Knotted1-like homebox)转录因子涉及多种激素的调控,从而调节植物生长
【基金项目】
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黄土高原苹果优良砧穗组合生态适应性筛选(A2990215082); 苹果砧穗组合筛选与互作分子机理研究(K3380217027); 苹果苗木培育技术示范(K338021501); 国家苹果产业技术体系(CARS-27); 国家自然科学基金面上项目(
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苹果(Malus domestica Borkh.)是世界四大水果之一,也是我国最重要的果树种类。黄土高原地区不利的环境因素和苹果花芽形成难等问题制约着该地区苹果产业的发展。性状优良的砧木能够改善品种的生长和抗逆性能。植物激素在调控苹果成花等生长发育过程,以及应对不利环境的响应中具有重要作用。据报道,KNOX(Knotted1-like homebox)转录因子涉及多种激素的调控,从而调节植物生长发育等生物学过程。本研究以‘长富2号’自根苗、‘长富2号’/M9矮砧苗等为试验材料,从MdKNOX基因入手,在苹果基因组中进行了该基因家族的成员鉴定,并对其表达特性和激素响应进行了初步分析。通过遗传学、分子生物学等手段,利用一系列转基因植物材料(拟南芥、番茄及苹果愈伤组织),明确了该家族中的两个成员在苹果生长发育过程中的功能和作用机制。主要研究结果如下:1.苹果基因组中含有22个KNOX基因根据金冠苹果(Golden Delicious)基因组数据,在苹果全基因组范围内鉴定到22个KNOX基因,分布于12条染色体上,6号和15号染色体包含最多的基因。MdKNOX蛋白均含有KNOX关键结构域,根据系统进化关系可分为三类,分别为I类,II类和KNATM类。基因重复是造成该家族基因多样性和进化的主要原因。多个MdKNOX基因在花芽中高表达,并且其表达在成花诱导期显著上调。大多数基因启动子序列中存在植物激素和环境信号响应元件,包括脱落酸、水杨酸、赤霉素、茉莉酸甲酯和生长素;成花诱导期,MdKNOX基因表达响应成花和胁迫相关激素的处理。MdKNOX15和MdKNOX19的启动子序列中含有多个串联的GRF转录因子的结合元件。通过酵母单杂交和双荧光素酶报告实验证实,MdGRF5(与拟南芥At GRF5转录因子同源)能够直接结合这两个MdKNOX基因的启动子,并抑制其转录活性,暗示GRF-KNOX相互作用相对保守。2.MdKNOX15通过调节GA水平调控苹果株高和开花植株高度和开花特性是苹果树育种中的两个主要考虑因素。相比于‘长富2号’的自根苗,‘长富2号’/M9嫁接树苗表现出显著的矮化和早花早果性状。MdKNOX15在嫁接苗的韧皮部高表达。MdKNOX15直接结合GA失活基因——MdGA2ox7的启动子并上调其表达,从而抑制MdKNOX15过表达的苹果愈伤的生长;在转基因拟南芥中,MdKNOX15上调多个GA失活基因并降低赤霉素水平,下调多个成花基因,使转基因拟南芥表现出GA缺失的矮化和晚花表型。亚细胞定位结果显示,MdKNOX15蛋白位于细胞核和细胞膜。以MdKNOX15为诱饵,进行酵母双杂交筛选获得了多个转录因子、翻译后修饰酶类、代谢酶类和细胞膜受体,暗示MdKNOX15参与广泛的生物学过程。MdKNOX15的N-和C-末端结构域均能与BELL1同源域转录因子Md BLH1发生互作。Md BLH1阻止MdKNOX15结合到MdGA2ox7启动子,并共同调节MdGA2ox7的转录水平及苹果愈伤组织的生长。该结果表明MdKNOX15与其他转录因子相互作用,通过调节GA水平来调控苹果的生长发育。3.MdKNOX19靶向ABI5调节苹果ABA敏感性和种子萌发苹果种子萌发和萌发后的幼苗生长是建立实生砧木的先决条件。不利的外部环境和植物激素脱落酸显著抑制苹果种子的发芽。在苹果的多个组织中,MdKNOX19和ABA信号传导途径的核心转录因子Md ABI5基因的转录水平均受到ABA处理的显著上调;MdKNOX19和Md ABI5的启动子活性也受到ABA处理的激活。亚细胞定位结果显示MdKNOX19和Md ABI5蛋白均定位于细胞核。MdKNOX19和Md ABI5过表达的转基因苹果愈伤均表现出ABA超敏性。MdKNOX19过表达拟南芥和番茄株系的种子萌发、萌发后幼苗生长、果实和种子发育均受到影响,并且ABA敏感性提高。不同转基因株系中ABI5基因及其下游靶基因的转录水平也发生显著变化。通过EMSA和双荧光素酶报告实验证实,MdKNOX19可以直接结合Md ABI5的启动子并上调其转录。该研究鉴定了一个新的ABI5上游的正调节因子,并且可能存在保守的MdKNOX19-Md ABI5-ABA作用模块来参与种子萌发和器官发育。综上,本研究提供了苹果KNOX家族基因成员组成、表达模式、转录调控等系统数据。初步揭示了MdKNOX15和MdKNOX19通过GA和ABA途径调节植物株高、成花和种子萌发的分子机制。研究结果为通过分子育种来改善苹果园艺性状提供了理论依据。
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