论文部分内容阅读
病毒病害是制约苹果产业高效、持续发展的重要因素。与真菌病害和细菌病害不同,植物一旦感染病毒病害,难以用其他方法治愈。栽培无毒苗是目前生产上防治病毒病害的有效方法。建立简易、高效的脱毒技术是培育和栽培无毒苗的必要条件。对苹果危害最大的潜隐病毒有三种,它们是苹果褪绿叶斑病毒（apple cholorotic leafsopt virus,ACLSV）,苹果茎痘病毒（apple stem pitting virus,ASPV）和苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus,ASGV）。ASPV不能侵染顶端分生组织,容易脱除,而ASGV能侵染顶端分生组织,难以脱除。褪黑素可以调控植物的生长发育,增强植物对非生物胁迫（如干旱、低温、盐碱等）和生物胁迫（如真菌和细菌）的抗性,但在增强植物对病毒抗性和脱毒方面极少有报道。本研究旨在:（1）以模式植物为材料,研究外施褪黑素对烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）的抗性。通过病毒相对含量、防御基因表达量和抗病相关因子含量测定,初步探究外施褪黑素促进植物抗病毒的机理,并将获得的结果在苹果植株上验证;（2）测试外施褪黑素脱除苹果ASGV和ASPV的效果,通过测定抗病相关因子和病毒相对含量及病毒在茎尖的定位,揭示褪黑素促进病毒脱除的机理;（3）测试褪黑素介导植物增强对病毒抗性的关键因子（SA和NO）脱除ASGV和ASPV的效果,建立脱毒新方法。获得的主要研究结果如下:（1）以心叶烟（Nicotiana glutinosa）、普通烟草（N.tabacum）和番茄（Solanum lycopersicum）模式植物为试材,研究了外施褪黑素对烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）抗性的效应。心叶烟（N.glutinosa）根部外施褪黑素,增强了植株对TMV局部侵染的抗性,以100μM褪黑素施用两次效果最佳,枯斑抑制率达37.4%。RT-q PCR检测结果表明,番茄根部外施褪黑素后,PR1和PR5基因表达上调,TMV相对含量下降,以100μM褪黑素施用两次时效果最显著。Dot-ELISA对TMV的测定结果也验证了外施褪黑素降低TMV的含量。根部外施褪黑素促进了番茄带毒植株中水杨酸（SA）和一氧化氮（NO）的积累,但对H2O2含量没有明显影响。外施NO供体硝普钠（SNP）和亚硝基谷胱甘肽（GSNO）可以上调PR1和PR5的表达,降低带毒植株中的病毒浓度。外施一氧化氮抑制剂c PTIO,明显降低褪黑素诱导的对TMV的抗性。以转水杨酸羟化酶基因（nah G）的普通烟草（N.tabacum cv.Xanthi-nn）为材料,接种TMV后发现,nah G烟草更易感病,接种3天后病毒浓度为野生型烟草的3倍,外施100μM褪黑素对nah G烟草的TMV相对浓度没有明显影响。以上研究表明,褪黑素介导的TMV抗性很可能依赖于NO和SA途径。（2）以单感ASGV的‘Gala’苹果试管苗为材料,培养在添加0-20μM褪黑素的增殖培养基中培养。结果表明,10-20μM褪黑素明显促进茎的增殖,10-15μM褪黑素明显促进茎的伸长。外施褪黑素明显提高试管苗內源吲哚乙酸（IAA）含量,以15μM褪黑素处理的效果最为明显。在含有15μM褪黑素的增殖培养基培养4周后,取0.5 mm带有2片叶原基的茎尖进行培养,茎尖培养的成活率与对照没有明显差异,再生率由对照组的47%提高至85%,脱毒率由对照组的0%提高到95%。外施15μM褪黑素明显促进试管苗内源SA和NO积累。RT-q PCR对病毒的定量检测表明,褪黑素处理显著降低带毒植株的病毒含量,病毒相对浓度下降约60%。免疫组织化学法对病毒定位研究发现,褪黑素处理抑制ASGV在茎尖的转运,扩大茎尖的无毒区。（3）以复合感染ASGV和ASPV的‘Gala’苹果试管苗为材料,取叶片外殖体培养在含有0-30μM褪黑素的再生培养基中,诱导不定芽。从不定芽取茎尖（0.3-0.5 mm、带2-3个叶原基）培养获得完整试管苗。结果表明,再生培养基中添加15-30μM褪黑素明显提高叶片不定芽再生力。对照组的不定芽发生率和不定芽数分别为81.6%和3.9。15μM和30μM褪黑素处理的不定芽发生率和不定芽数分别为100%和5.8与5.2,显著高于对照组。再生培养基中添加褪黑素（15-30μM）能提高茎尖的再生率及脱毒率,以15μM褪黑素处理对ASGV和ASPV脱毒率最高,分别达到53%和100%。免疫组织化学法对病毒定位研究发现,外施褪黑素扩大茎尖的无毒区,促进茎尖培养脱除病毒。（4）以复合感染ASGV和ASPV的‘Gala’苹果试管苗为材料,培养在添加了SA和NO供体硝普钠（SNP）的培养基培养4周后,取茎尖（0.3-0.5mm、带2-3个叶原基）培养获得完整试管苗。结果表明,低浓度的SA（10μM）与SNP（10μM和50μM）对试管苗的伸长和增殖无显著影响,高浓度SA（100μM）与SNP（70μM）明显抑制试管苗的生长,但明显提高ASGV和ASPV的脱毒率。本研究首次揭示了外施褪黑素能明显提高植物对TMV的抗性。外施褪黑素、SA及NO供体硝普钠（SNP）能有效脱除ASGV和ASPV,并初步揭示了外施褪黑素提高脱毒率的机理。本研究为植物脱毒开辟了新的途径,具有重要的理论和应用研究价值。