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目的:苯扎溴铵在医疗卫生行业、畜牧兽医行业、食品加工和其他工业环境中的使用越来越广泛,细菌对其的抗性也愈发显现。本研究通过分离福建省部分河流和猪场环境中的水源性肠球菌,了解其对抗生素和苯扎溴铵的抗性现状,为后期的用药提供新的方向和理论基础;为了进一步了解生物膜介导的耐药机制,建立苯扎溴铵模型,对不同生长时期肠球菌菌毛基因和黏附因子的表达情况进行研究;同时探索微生态模型中苯扎溴铵条件下的肠球菌耐药性及各群体感应系统间的相互关系。方法:(1)运用肠球菌选择培养基和显色培养基进行临床分离、鉴定水源性肠球菌,用微量肉汤法测分离菌株的MIC值;应用PCR方法检测耐药基因vanA、vanB、vanC、VanC2/3、gryA、tetM、tetL、tetS、mefA、ermB和msrC及消毒剂抗性基因qacA/B、qacC、qacG、qacE△1和qacJ;多重PCR技术进行肠球菌种水平的鉴定。(2)设立5个苯扎溴铵浓度组,分别为 1000 ng/mL、500 ng/mL、100 ng/mL、10 ng/mL和0 ng/mL,每组两个重复。分别用对培养至对数中期(3.5 h)、对数后期(5 h)及稳定期(7 h)的肠球菌对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)进行黏附,并用荧光定量PCR法测每个时期各浓度肠球菌的菌毛相关基因和黏附因子的mRNA相对表达情况。(3)建立微生态模型。采集福州森林公园深处土样,设置苯扎溴铵终浓度分别为2000 ng/mL、200 ng/mL、20 ng/mL、2 ng/mL和0 ng/mL的5个实验组。定期采集水样做药敏试验并检测耐药基因和抗性基因,荧光定量PCR法检测微生态系统中各时期不同浓度组肠球菌的fsr群体感应系统和cyl群体感应系统相关基因的mRNA相对表达量。结果:(1)福建省部分河流和猪场环境中采集的水样中共分离出水源性肠球菌75株,分离率为71.43%,其中包括粪肠球菌31株,占41.33%;屎肠球菌11株,占14.67%。药敏结果显示,75株肠球菌对红霉素的耐药率最高,为81.33%(56/75),其次是四环素,为74.67%(56/75),对氨苄西林和万古霉素最敏感,耐药率仅4.00%(3/75)和2.67%(2/75);有22.67%(17/75)的分离菌对苯扎溴铵的MIC值高于标准菌,最高表现为8倍MIC标准菌;临床分离菌的多重耐药率为74.67%,以4～5重耐药为主,最高达到6重耐药;PCR结果共有9种耐药基因被检出,其中gyrA基因的检出率最高为93.33%,其次是tetL也高达80.00%,表型为耐药的菌株耐药基因检出率高于敏感株。种水平鉴定结果显示粪肠球菌较屎肠球菌为优势菌,占41.33%。(2)细胞黏附实验结果显示,肠球菌各生长时期对宿主细胞的黏附作用具有差异性,对数期的黏附能力强于稳定期,低浓度组的黏附性强于高浓度组;低浓度(10 ng/mL)的苯扎溴铵对菌毛生成相关基因ebpA、ebpB、ebpC和strA基因的上调作用主要在肠球菌生长对数中期,对ebpR影响较大的是较高浓度组的稳定期;gelE基因的表达主要在后期,且较低苯扎溴铵浓度可以显著提高其表达;在对数中期随着苯扎溴铵浓度的增加(100～1000 ng/mL),ace的mRNA表达也相应增加,对数后期则相反。(3)微生态系统中,苯扎溴铵在第7天时肠球菌对8种药物的MIC值明显增加,并对VAN、CHL、BB、CIP、ERY和TET产生耐药性,但是在第1天就检出tetL和ermB等耐药基因。fsrABC基因较第0天几乎不表达,但对下游的gelE和sprE的表达具有明显的促进作用,尤其在第7天和第28天出现表达峰值;cylLL和cylLs的表达量远高于其他cyl相关组分基因;前21天cylR1和cylR2表达量相当,28天时后者显著高于前者;其他cyl基因的表达峰值均在28天出现,且高浓度苯扎溴铵(≥200 ng/mL)促进、低浓度(≤20 ng/mL)在后期表现为显著的抑制作用。结论:(1)福建部分地区水源性肠球菌分离率较高且多重耐药现象严重,分离菌携带多个相关耐药基因,是导致分离株对抗菌药物产生耐药的主要原因;分离菌整体对苯扎溴铵较敏感,耐受水平低;粪肠球菌为优势菌且耐药率高于屎肠球菌。(2)苯扎溴铵可以显著提高肠球菌在生长对数中期对宿主细胞IPEC-J2细胞的黏附能力。低浓度苯扎溴铵对宿主细胞的黏附能力与菌毛生成量有关,高浓度苯扎溴铵主要通过刺激黏附基因ace的高表达来影响对宿主细胞的黏附。(3)亚抑菌浓度的苯扎溴铵会导致肠球菌对抗生素的MIC值增加,并产生耐药性;苯扎溴铵对fsr群体感应系统相关基因fsrABC基因表现为完全抑制作用,高浓度苯扎溴铵(≥200 ng/mL)对gelE、sprE及cyl群体感应系统相关组分基因的表达具有明显的促进作用,低浓度(≤20 ng/mL)在21天之后表现为抑制作用。苯扎溴铵引起的抗生素耐药和群体感应系统之间存在一定的联系。