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黄花蒿（学名:Artemisia annua Linn.）,菊科,蒿亚属,一年生草本植物,分布广泛在我国各地,主要在广西、四川、湖南等中国南方地区大量种植。黄花蒿为中药青蒿的基原植物,是青蒿素唯一的植物天然来源。青蒿素作为一种具有过氧桥结构的新型倍半萜内酯,是目前针对恶性疟原虫耐药和脑疟疾致病菌株的最佳治疗剂,挽救了数百万人的生命。我国在青蒿素原料供给方面拥有绝对的资源优势,是世界市场青蒿素类原料供应者。然而天然青蒿中青蒿素含量很低（0.01%1%,DW）,受资源、环境等的限制,使得青蒿供应不足,难以满足青蒿素全球市场上的需要。因此,如何提高黄花蒿中青蒿素的产量成为黄花蒿研究的热点。其一,目前,虽然青蒿素的生物合成途径已解析的比较清楚,但是从青蒿酸到青蒿素的合成仍存在瓶颈,而青蒿素在黄花蒿中的调控机制尚不清晰。因此本研究收集不同产地的黄花蒿资源,通过青蒿素等萜类化合物的检测和转录组的联合分析,分析不同青蒿素含量的黄花蒿种质的基因表达水平变化,从而阐释青蒿素合成调控可能的分子机制。其二,为了培育高含量青蒿素的黄花蒿品种,本研究将CRISPR（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats）/Cas9技术应用在黄花蒿中。CRISPR/Cas9是一种有效的基因敲除工具,它利用一小段RNA作为引导,特异性识别靶向序列,再用核酸内切酶Cas9对靶向序列进行酶切,破坏其DNA结构,成功实现基因编辑。相比于第一代基因编辑系统锌指核酸酶（ZFNs）系统和第二代基因编辑系统类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）,CRISPR/Cas9构建简单,打靶特异性高。本研究筛选青蒿素合成途径中以FPP为底物的5个竞争性支路关键酶,分别构建CRISPR/Cas9多靶点表达载体并转化黄花蒿,为CRISPR/Cas9技术在黄花蒿中的应用和高青蒿素含量黄花蒿种质的培育奠定基础。具体研究结果如下:1、不同产地黄花蒿的化学和转录组分析研究本研究收集来自我国吉林（JL）、北京（BJ）、广西（GX）、湖北（HUB）和海南（HAN）等地的黄花蒿种源,通过超高效液相色谱-串联四级杆质谱检测法（UPLC-ESI-QQQ-MS）的方法进行青蒿素及青蒿乙素含量分析,实验结果发现吉林、北京、广西、湖北、海南和YQ2（栽培品种）的青蒿素含量呈依次上升趋势,北京、吉林、广西、湖北、YQ2和海南的青蒿乙素呈依次下降趋势。为了探讨青蒿素含量高低不同的黄花蒿萜类代谢的差异,从收集样品中选取青蒿素含量具有代表性的吉林、湖北和海南地区的黄花蒿种质资源,提取其RNA且每组设置3个生物学重复,进行转录组分析。本次在3个地区的样本中测序结果共比对上基因组序列在31 938-32 612条,并将3个地区进行两两比较发现HAN和HUB的差异基因共12 343个、HUB和JL的差异基因共12 912个及JL和HAN的差异基因共11 697个,其中三组之间的差异基因共注释到2 410条。通过GO功能注释分析,对HUB和JL的黄花蒿中差异表达分析,注释到30,847个基因,HAN和JL的黄花蒿中差异表达注释到39 726个基因。对青蒿素生物合成途径中的差异表达基因分析,结果发现在HAN这种青蒿素含量高的品质中青蒿素合成主路上的基因表达普遍偏高（CYP71AV1、DBR2、DXR、HMGS、ADS）,支路上的基因表达量偏低（SQS、BFS、ECS、GAS）。此外,KEGG分析发现,差异表达基因除了在青蒿素合成等萜类途径富集,还显著富集到植物-病原互作途径,推测青蒿素的合成调控可能与病原菌互作有关系。本研究通过不同产地黄花蒿的化学和转录组分析研究,为进一步阐明青蒿素及其衍生物的积累机制奠定了基础。2、CRISPR/Cas9技术在黄花蒿中的应用初探本研究通过调整农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间、激素浓度等遗传转化的关键步骤,优化了现有的黄花蒿遗传转化方法,建立了高效的黄花蒿遗传转化体系。研究发现:黄花蒿转化中最好的外植体黄花蒿生长10天左右的两片真叶;最佳侵染农杆菌浓度OD600值为0.3,侵染时间为10 min;最适合的共培养时间为3天;最适的卡那霉素选择压为50 mg/L;外植体在1/2MS+0.1 mg/L NAA（萘乙酸）+0.5 mg/L IBA（吲哚丁酸）+200 mg/L Cef培养基上生根率最高（>90%）。在此基础上,本研究从GenBanK下载整理了5个已知的FPP竞争性萜类合成酶基因SQS（squalene synthase）、BFS（beta-farnesene synthase）、GAS（germacrene A synthase）、CPS（beta-caryophyllene synthase）和ECS（8-epicedrol synthase）的基因组序列和CDS序列,其中BFS、ECS、GAS和CPS的外显子均为7个,内含子均为6个,SQS外显子12个,内含子11个;通过CRISPR-P v2.0（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）网站,设计了5个FPP竞争性萜类合成酶基因sgRNA各2个,分别构建基于CRISPR/Cas9多靶点编辑的载体PTG/Cas9-SQS、PTG/Cas9-BFS、PTG/Cas9-ECS、PTG/Cas9-GAS、PTG/Cas9-CPS;然后,以本实验室保存的黄花蒿种子为材料,转化黄花蒿,经过PCR鉴定,共获得黄花蒿再生植株33株,其中PTG/Cas9-SQS 25株,PTG/Cas9-ECS 5株PTG/Cas9-GAS 3株。