在本研究中,我们在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达大鼠脂酰辅酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase,ACOX),利用镍离子亲和层析、透析进行纯化和除盐,获得具有较高纯度的ACOX用于酶活检测。通过脂酰辅酶A底物浓度的最低检测限、酶活性和酶量的相关系数、不同方法所测酶活大小之间的相关性等多个方面,进行ACOX酶活性测定方法的比较;这些方法包括测定263 nm处的烯酰辅酶A产物吸光度增加的紫外可见分光光度法、香豆素荧光强度减少的荧光分光光度法和溶氧下降的测氧仪法。为脂肪酸代谢等有关疾病的理论研究中,对组织内ACOX酶活性的检测工作提供一定的方法学上的参考依据。然后以差速离心的方法分离大鼠肝组织中的过氧化物酶体,利用不同的方法测定过氧化物酶体中ACOX酶的活性。重组表达的ACOX酶分子量为72 k Da,蛋白浓度为2.3 mg/m L。合成的棕榈酰辅酶A(palmitoyl-CoA,PA-CoA)底物高效液相色谱出峰时间约为24.3 min,浓度为8.6 m M。与UV法的脂酰辅酶A底物浓度最低检测限1720 n M相比,荧光法和测氧仪法的均较低(860 n M)。但从酶活与酶量之间的相关性来比较,UV法为0.98,荧光法和测氧仪法比较低,R~2值分别为0.91和0.69。荧光法所测酶活与UV法所测酶活之间的相关性比较高,R~2=0.88,而测氧仪法则为0.8。荧光法测得的酶活数值是最小的,可能是由于过氧化氢不稳定所导致的。测氧仪法测得的酶活最大,可能由于电极校正、搅拌等原因,导致氧气扩散速度增加和电极电流增加;而且由于测氧仪法反应体系的体积是其它方法的3倍,对于酶样品和昂贵的脂酰辅酶A底物的消耗也比较大。通过对大鼠肝脏组织进行匀浆和差速离心,我们获得了肝脏的过氧化物酶体部分,按照上述方法对ACOX进行检测。荧光法和测氧仪法均能测出有活性,酶活分别为3.47和31.2 U/m L。而以PA-CoA为底物时,由于烯酰辅酶A产物进一步的β-氧化、263 nm处高的背景吸收等原因,组织内ACOX酶活的UV法检测比较困难;但可以利用具有特殊结构的3-吲哚丙酰辅酶A(3-indolepropionyl-CoA,IP-CoA)底物克服这些缺点,测出样品酶活为2.4 U/mL。