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目的1.明确MAP4K4在蛛网膜下腔出血后早期血脑屏障损伤的作用;2.探讨MAP4K4诱导蛛网膜下腔出血后血脑屏障快速损伤可能的机制。方法1.评估SAH后MAP4K4在时间进程和细胞位置上的蛋白表达差异。42只小鼠随机分为7组(n=6):Sham组,SAH 3小时组,SAH 6小时组,SAH 12小时组,SAH24小时组,SAH 48小时组和SAH 72小时组。通过Western blotting(WB)检测左半球皮层中MAP4K4的表达。选用SAH后24小时小鼠,免疫染色MAP4K4和凝集素(内皮细胞标记物)共标,以确定MAP4K4在皮层内皮细胞上的表达(n=3)。2.侧脑室注射MAP4K4小干扰RNA和有效剂量MAP4K4重组蛋白。159只成年C57B6J小鼠被随机分成8组:Sham(n=25),SAH(n=12),SAH+NS(2μL正常生理盐水,n=19),SAH+MAP4K4 10 ng/μL(n=12),SAH+MAP4K4 50ng/μL(n=19),SAH+MAP4K4 200 ng/μL(n=12),SAH+Scr si RNA(n=25),SAH+MAP4K4 si RNA(n=25)。神经损伤评估采用改良Garcia评分(24和72小时)和平衡木实验(n=6)。此外,在24小时和72小时进行脑含水量测定(n=6),SAH后24小时进行Evans blue通透性评估(n=6),以评估血脑屏障损伤(n=6)。在SAH诱导后24小时采用免疫染色法检测皮层内皮细胞的连续性(n=3)。3.与此同时,为了探究BBB破坏的作用机制,选取60只成年C57B6J小鼠分为5组(n=12):Sham,SAH+NS,SAH+MAP4K4 50 ng/μL,SAH+Scr si RNA,SAH+MAP4K4 si RNA。行免疫印迹检测p-p65,zonula occludens-1(ZO-1)和Claudin 5的表达式(n=6),明胶酶谱检测小鼠大脑左半球MMP9的表达。4.为了研究MAP4K4的抑制剂PF-06260933(PF)的作用,并筛选最佳剂量,我们使用了135只成年C57B6J小鼠。Sham(n=31),SAH(n=12),SAH+vehicle(双蒸馏水,n=31),SAH+PF-06260933 1mg/kg(n=12),SAH+PF-06260933 10mg/kg(n=31),SAH+PF-06260933 100mg/kg(n=12)。SAH后15min通过小鼠灌胃法分别服用1 mg/kg、10 mg/kg或100 mg/kg PF(Merc,Darmstadt,Germany)。在SAH后24和72小时(n=6),采用改良Garcia评分和平衡木实验评估神经功能障碍。采用脑含水量和Evans blue通透性评估对血脑屏障损伤进行分析。通过免疫荧光(n=3)和Western blot(n=6)来检测p-p65、ZO-1和claudin 5的表达。明胶酶谱法检测MMP9蛋白水平(n=6)。结果1.MAP4K4蛋白的表达量在造模的12h、24h、48h和72h组显著增加。同时蛛网膜下腔出血后24小时左侧皮层免疫组织化学染色提示内皮细胞中MAP4K4明显升高。2.MAP4K4 si RNA可以有效的抑制SAH后MAP4K4的表达,注射重组蛋白的SAH+MAP4K4 50 ng/μL和SAH+MAP4K4 200 ng/μL组和SAH+NS组相比有更严重的神经功能评分降低,脑水肿显著的增加同时伊文思蓝外渗加剧。而MAP4K4 si RNA组较SAH+Scr组24小时的神经功能障碍有明显改善,脑水肿显著减少,伊文思蓝泄漏也显著降低。3.SAH后24小时,经MAP4K4重组蛋白注射和MAP4K4 si RNA预处理后,同侧皮质的内皮细胞和紧密连接蛋白5(Claudin 5)标记染色显示内皮细胞和紧密连接蛋白的完整性破坏,同时MAP4K4重组蛋白的使用增加了内皮细胞和紧密连接蛋白不连续性,而MAP4K4 si RNA组的连续性显著改善。4.Western blot及明胶酶谱结果显示,MAP4K4重组蛋白增加了P-p65和MMP9的水平,并使ZO-1和Claudin 5水平降低,同时MAP4K4 si RNA组逆转了上述趋势。5.MAP4K4的高选择性小分子抑制剂PF-06260933(PF)注射后,10 mg/kg和100 mg/kg PF的剂量明显改善神经功能,降低脑含水量,而1mg/kg无明显效果。6.Western blot及明胶酶谱结果显示,给予PF后,P-p65及MMP9的表达量均减少,同时ZO-1和Claudin 5蛋白表达量增加。结论本研究表明,SAH后内皮细胞中MAP4K4表达量分别在24h、48h和72h时升高。MAP4K4重组蛋白50 ng/μL和200 ng/μL浓度可使神经功能降低和脑水肿加重,而MAP4K4的抑制剂能有效地逆转这些趋势。MAP4K4通过破坏连续的ECs和紧密连接蛋白来导致血脑屏障的破坏。进一步的机制研究表明,MAP4K4增强了p-p65表达并激活了下游的MMP9,这是紧密连接蛋白降解的主要因素。综上所述,MAP4K4可能是减少SAH后BBB损伤的潜在靶点。