论文部分内容阅读
癌症是人类身体健康的巨大威胁之一,癌症的发生、发展与基因有密不可分的关系。在肿瘤发生初期,相关DNA标志物的浓度通常较低,一般的检测方法难以检出,导致错过最佳治疗期,造成无法挽回的后果。因此,发展高灵敏度、高特异性的DNA检测方法,实现对癌症等重大疾病的早期诊断、早期治疗,提高患者生存率具有非常重要的意义。本论文以癌症相关基因为研究对象,结合纳米技术和信号放大技术,设计了两种高灵敏度DNA检测新方法:纳米金/生物条形码放大的ICP-MS基因检测、生物条形码/金标银染放大的电化学基因检测。主要研究内容如下:（1）纳米粒子的制备、修饰及表征分析。分别采用柠檬酸钠还原法合成纳米金（AuNPs）、化学共沉淀法合成磁性纳米粒子（MNPs）、St?ber水解法合成二氧化硅纳米粒子（SiO2）,并用氨基硅烷对磁性纳米粒子和二氧化硅纳米粒子进行氨基功能化。采用透射电子显微镜（TEM）,红外光谱仪（FTIR）,紫外-可见光谱仪（UV-Vis）、X射线衍射仪（XRD）和振动样品磁强计（VSM）对所制备的纳米粒子进行了表征分析。结果显示,纳米金的粒径约为13 nm,二氧化硅纳米粒子的粒径约为95 nm,且分散性能良好。磁性纳米粒子的粒径约为31 nm,饱和磁化强度为58 emu/g,具有超顺磁性。磁性纳米粒子和二氧化硅纳米粒子表面成功修饰氨基硅烷。（2）纳米金/生物条形码放大的ICP-MS基因检测新方法。基于生物条形码技术,将二氧化硅纳米粒子标记DNA和纳米金结合构建SiO2/AuNPs条形码探针,与靶DNA以及磁性纳米粒子表面修饰DNA杂交形成“三明治”结构,磁分离后,通过二硫苏糖醇（DTT）替换纳米金表面的寡核苷酸,释放出纳米金,采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）检测金离子浓度。本论文优化了SiO2/AuNPs条形码探针的制备、DNA杂交温度和杂交时间。结果表明,SiO2/AuNPs条形码探针的最佳DNA比例为75:1,AuNPs分散液的最佳修饰量为4 mL,最佳杂交温度和杂交时间分别为42°C和90 min。该DNA检测方法的最低检测限为1 fmol/L,线性范围为1500 fmol/L,能清楚地区分DNA正错配,具有良好的检测特异性。（3）生物条形码/金标银染放大的电化学基因检测新方法。将纳米金标记探针与二氧化硅纳米粒子构建的SiO2/AuNPs条形码探针,与靶DNA以及电极表面修饰的DNA探针杂交,利用纳米金的催化作用,银离子在纳米金表面还原成银壳,采用线性扫描伏安法（LSV）对沉积的银进行电化学检测。本论文考察了电极封闭剂、封闭时间以及银沉积时间等对电化学检测的影响。结果显示,将巯基己醇用于封闭金电极可以有效降低背景信号,最佳封闭时间为3 h,最佳银染时间为6 min。该电化学DNA生物传感器的最低检出限为0.23 fmol/L,线性范围为1 fmol/L10 pmol/L,能清楚地区分DNA正错配,具有良好的检测特异性,且重现性、稳定性良好。