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第一部分三种大鼠内耳膜组织微量核酸提取方法的比较目的比较三种核酸提取方法在大鼠内耳组织微量核酸提取中的应用特点，找出最适合内耳膜组织的提取方法。材料与方法用碱变性法、酚—氯仿抽提法及Trizol法分别对大鼠内耳组织膜组织进行核酸的提取，应用分光光度计和PCR法分析所提取核酸的质和量。结果三种方法中，以酚—氯仿抽提法所得的总DNA的纯度(0D260／280)和量最高。三种方法所得的DNA都可经PCR扩增出线粒体DNA片段，除碱变性法外，其余两种方法所得的DNA都可经PCR扩增出核DNA片段。Trizol法除能提取DNA外，还可同时提取出RNA。Trizol法所提取的RNA经RT-PCR可扩增出核DNA和线粒体DNA片段。结论本实验所选用的三种提取方法均可从微量的大鼠内耳膜组组织中提取出足质足量的核酸以供PCR分析。三种方法均可从微量的大鼠内耳组织中提取出足质足量的核酸供PCR分析。仅需提取线粒体DNA时可选取碱变性法，同时需要线粒体DNA和核DNA时则可选择酚—氯仿法或Trizol法，其中酚—氯仿法的得率和质量更高，但耗时稍长。而Trizol法则可同时提取到总DNA和总RNA，所得的DNA和RNA经PCR扩增均可扩增出核片段和线粒体片段。第二部分D-半乳糖注射致早衰大鼠模型的建立及相关的听力变化目的探讨对大鼠进行两种剂量的D—半乳糖注射后，大鼠听力、内耳组织酶活力变化及各器官中线粒体DNA4834bp缺失(CD)及其它缺失突变的发生情况。材料与方法分别用高剂量(150mg／kg／d)和低剂量(50mg／kg／d)D-半乳糖对大鼠进行每日颈背部皮下注射共8周造成D—半乳糖过荷模型，以生理盐水作对照组，比较造模前后大鼠ABR阈移判断其听力变化。然后处死动物，取出大鼠的心、肝、脑、颞肌、肾脏、内耳组织，并从腹主动脉抽出1ml血。应用试剂盒检测内耳组织酶活力，巢式PCR检测各器官CD及其它缺失的发生情况。结果150mg／kg／d半乳糖组和50mg／kg／d半乳糖组大鼠的内耳组织GSH-Px和Na+，K+-ATPase酶活力降低较对照组降低(5.44±1.84，6.86±1.2V 11.40±2.22 activity unit；0.34±0.04，0.40±0.08 V 0.64±0.16μmolpi／mgprot／hour)，在高剂量组变化尤为明显。但相应的听力变化并不明显(P＞0.05)。在各器官中，肝脏和颞肌的CD发生率最高，而内耳和血细胞中发生率则明显低于其它组织，尤其在血细胞中最低。同时检测了nt5253～7244，nt7153～9193，nt9176～11431，nt11269～13444和nt13933～16278共5个区段内的2kb以下缺失突变，结果所有标本中无阳性发现。结论每日皮下注射D—半乳糖8周可致大鼠早衰状态，早衰大鼠的生化指标和CD发生率都随之明显改变，但内耳CD的发生也许并不足以导致大鼠听力的变化。而在用巢式PCR对CD的检测中用外周血作标本时可能出现“假阴性”，即检出率低于实际突变率的情况。应用特定组织的活检结合巢式PCR或可提高CD的检出率。第三部分D—半乳糖过荷致氨基糖甙类抗生素耳毒易感性及其可能机制目的探讨大鼠内耳组织线粒体DNA4834bp缺失及其它缺失与氨基糖甙类药物耳毒敏感性之间的关系。材料与方法分别用高剂量(150mg／kg／d)和低剂量(50mg／kg／d)D-半乳糖对大鼠进行每日颈背部皮下注射共8周后，再用硫酸卡那霉素(500mg／kg／d)腹腔注射10天，以生理盐水作对照组，比较造模前后大鼠ABR阈移判断其听力变化。应用试剂盒检测内耳组织酶活力，巢式PCR检测内耳mtDNA4834bp缺失(CD)及其它缺失的发生情况。结果两组仅注射D—半乳糖的大鼠的内耳组织酶活力较阴性对照组降低，内耳发生CD和mtDNA7506bp缺失率较阴性对照组增高，尤其是高剂量组，两种缺失中CD的突变率更高。同时检测了nt5253～7244，nt7153～9193，nt9176～11431，nt11269～13444和nt13933～16278共5个区段内的2kb以下缺失突变，结果120耳中无阳性发现。但两种剂量D—半乳糖所致的听力变化并不明显。硫酸卡那霉素注射可导致明显的耳毒性(38.75 Vs 23.75 dB SPL)，而提前注射了D—半乳糖的大鼠对硫酸卡那霉素耳毒性的敏感程度较未提前注射D—半乳糖的大鼠更强(85.42，77.50 Vs 38.75 dB SPL)。结论D—半乳糖注射不足以引起明显的听力变化，但D—半乳糖注射所致的内耳组织线粒体大片段缺失或与氨基糖甙类抗生素耳毒敏感性有关。第四部分核因子在大鼠对氨基糖苷类抗生素耳毒易感性中的作用目的研究线粒体相对拷贝数(copy number)，核编码的线粒体转录因子A(MTFA)，腺嘌呤核苷酸移位酶1(ANT1)mRNA水平及线粒体编码的COXⅢ和NDⅡmRNA水平以及线粒体DNA大片断缺失在D—半乳糖致氨基糖苷类抗生素耳毒易感大鼠内耳膜迷路中的变化，探讨核因子与线粒体因子相互作用在大鼠对氨基糖苷类抗生素耳毒易感性中的作用机制。材料与方法20只3月龄Wistar大鼠(100～150g)随机分为2组，A组15只，以D-半乳糖50mg／kg／d连续腹腔注射8周，再以卡那霉素500mg／kg／d连续腹腔注射10天；B组5只，以生理盐水50mg／kg／d连续腹腔注射8周，再以卡那霉素500mg／kg／d连续腹腔注射10天。用药前后分别测ABR阈值，以ABR阈移判定氨基糖苷类药物的耳毒性，以MTFA和ANT1的mRNA水平反映核因子的变化，以COXⅢ和NDⅡ的mRNA水平反映线粒体因子的变化。结果线粒体相对拷贝数：A组4.34±1.26，B组7.04±1.54，两组间有显著性差异(P＜0.05)。大鼠膜迷路mRNA水平：MTFA A组1.87±0.33，B组4.34±1.79；ANT1：A组3.35±0.85，B组6.05±1.62；COXⅢ：A组2.43±0.74，B组2.61±0.83：NDⅡ：A组2.64±0.53，B组2.77±0.61。A组MTFA的mRNA水平较B组明显降低(P＜0.01)，而A组的ANT1的mRNA水平较B组明显升高(P＜0.01)，而线粒体编码的COXⅢ和NDⅡ的mRNA水平在A组和B组无明显差异。注射氨基糖苷类药物后的ABR阈移：A组：73.54±11.28dBpeSPL，B组：40.63±9.04dBpeSPL，A组平均阈移明显高于B组(P＜0.05)。A组内耳组织发生mtDNA4834bp缺失突变的大鼠亦明显高于B组。结论核因子—线粒体因子互相调节，协同作用可能与大鼠对氨基糖苷类抗生素耳毒易感性有关。