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目的:慢性肾脏疾病可导致渐进性、不可逆性的肾单位丢失、肾组织损伤、继而出现肾功能障碍,并最终进展至终末期肾功能衰竭,已成为全球普遍的公共健康问题。肾脏纤维化是多种慢性肾脏疾病发生发展的中心环节和重要特征,是其进展至终末期肾功能衰竭的共同通路之一。由于肾脏纤维化的诊断尚缺乏早期、精准的特异性标志物,其治疗亦缺乏针对性,因此,阐明其发病机制,对于预防及早期干预疾病的发生发展具有重要意义。转化生长因子β是一类重要的致纤维化生长因子,其家族成员TGF-β1在肾脏细胞中有广泛表达,可通过抑制细胞外基质降解,在肾间质基质沉积中发挥重要作用。细胞周期素依赖性蛋白激酶5作为一种蛋白激酶,通过磷酸化相应底物发挥其生理学作用。本课题组前期研究发现,高糖、TGF-β1等因素,可导致p35断裂为p25,继而激活Cdk5,使其激酶活性异常升高,在糖尿病肾病足细胞损伤及凋亡的发生发展过程中起了重要作用。本探究在此基础上,以人肾小球系膜细胞为研究对象,重点探讨TGF-β1调控Cdk5表达在系膜细胞外基质沉积中所起的作用,以期进一步明确TGF-β1促进肾脏纤维化的作用机制,为探索肾脏纤维化的有效防治提供理论依据。方法:体外培养人肾小球系膜细胞,10 ng/ml TGF-β1刺激细胞,实验分组:1.观察TGF-β1对Cdk5蛋白及m RNA表达的影响:HMC接种于6孔板,10 ng/ml的TGF-β1分别刺激0、3、6、12、24 h后,Western blot、免疫荧光化学法检测Cdk5、p35/25蛋白表达情况,Real time-PCR检测Cdk5 m RNA的表达。2.观察Cdk5对系膜细胞CollagenⅣ、FN表达的影响:转染Cdk5野生型质粒,并设置空白对照组,质粒对照组,Western blot、免疫荧光化学法检测CollagenⅣ、FN蛋白表达情况。3.观察Cdk5抑制剂Roscovitine对TGF-β1刺激HMC后CollagenⅣ、FN表达的影响:分为Control组、TGF-β1刺激组（10 ng/ml的TGF-β1刺激24 h）,TGF-β1+Roscovitine组（10 ng/ml的TGF-β1和10μM Roscovitine混合培养基刺激24 h）,Western blot、免疫荧光化学法检测CollagenⅣ、FN蛋白表达情况,Real time-PCR检测CollagenⅣ、FN m RNA的表达。4.观察Cdk5敲低质粒对TGF-β1刺激HMC后CollagenⅣ、FN表达的影响:分为Control组、TGF-β1+质粒对照组Vector组,TGF-β1+DN-Cdk5组。TGF-β1+Vector组,TGF-β1+DN-Cdk5组,分别转染相应质粒24 h后,再给予TGF-β1刺激24 h,Western blot、免疫荧光化学法检测CollagenⅣ、FN蛋白表达情况,Real time-PCR检测CollagenⅣ、FN m RNA的表达。结果:1.TGF-β1对系膜细胞Cdk5、p35/p25表达的影响:10 ng/ml TGF-β1作用于肾小球系膜细胞0、3、6、12、24 h后,随着刺激时间的延长,Western blot检测Cdk5蛋白表达呈时间依赖性增加。P35/p25是Cdk5的特异性协同激动剂,TGF-β1作用后,p35蛋白表达与Cdk5一致,也呈时间依赖性增加;p25蛋白表达,在12 h有所下降,24 h达高峰。Real time-PCR法检测TGF-β1作用于系膜细胞0、12、24 h后,Cdk5 m RNA表达的变化。与0 h相比,TGF-β1作用12 h、24h后,Cdk5 m RNA均明显增加（p<0.05）,作用24 h时,Cdk5 m RNA增加约3.67倍。免疫荧光法检测TGF-β1刺激24 h后,Cdk5、p35/p25表达均明显增高。可见TGF-β1刺激系膜细胞后,Cdk5被激活。2.Cdk5对系膜细胞CollagenⅣ、FN表达的影响:与空白对照组和空白质粒转染组相比,转染Cdk5野生型表达质粒后,Western blot检测CollagenⅣ、FN蛋白表达均明显增高（p<0.05）;免疫荧光结果也显示,转染Cdk5质粒后,CollagenⅣ（红色荧光）、FN（绿色荧光）蛋白表达明显增强。3.抑制Cdk5激酶活性,TGF-β1对系膜细胞CollagenⅣ、FN表达的影响:与空白对照组相比,TGF-β1刺激后,Western blot结果显示系膜细胞CollagenⅣ、FN蛋白表达均明显增加（P<0.05）,而应用Roscovitine后,CollagenⅣ、FN表达明显降低（P<0.05）;Real time-PCR结果显示,TGF-β1刺激后,CollagenⅣ、FN m RNA表达明显增加（P<0.05）,应用Roscovitine后,m RNA表达降低（P<0.05）;免疫荧光结果显示,与对照组相比,TGF-β1刺激后,CollagenⅣ（红色荧光）、FN（绿色荧光）表达明显增多,应用Roscovitine干预后,CollagenⅣ、FN表达减少。4.转染Cdk5抑制性质粒,TGF-β1对系膜细胞CollagenⅣ、FN表达的影响:与空白对照组相比,TGF-β1加空白质粒转染组,Western blot结果检测系膜细胞CollagenⅣ、FN蛋白表达均明显增加（P<0.05）,而转染Cdk5抑制性质粒后,与TGF-β1加空白质粒转染组相比,CollagenⅣ、FN表达明显降低（P<0.05）;Real time-PCR结果可见,TGF-β1加空白质粒转染后,CollagenⅣ、FN m RNA表达明显增加（P<0.05）,转染Cdk5抑制性质粒后,m RNA表达降低（P<0.05）;免疫荧光结果显示,与对照组相比,TGF-β1加空白质粒转染组,CollagenⅣ、FN表达明显增多,转染Cdk5抑制性质粒后,与TGF-β1加空白质粒转染组相比,CollagenⅣ、FN表达减少。结论:1.一定浓度的TGF-β1作用于人肾小球系膜细胞,可致细胞Cdk5蛋白及m RNA表达增加,胶原蛋白CollagenⅣ、FN表达增加。2.抑制Cdk5激酶活性或转染Cdk5抑制性质粒,可降低胶原蛋白CollagenⅣ、FN表达。3.Cdk5可能在TGF-β1致肾小球系膜细胞外基质沉积中发挥了重要作用。