肠黏膜组织的缺血再灌注损伤(Ischemia/reperfusion injuries，I/R)是一种常见的临床病理过程，见于多种疾病或损伤状态。肠黏膜上皮细胞是对缺血、缺氧极为敏感的组织，缺血再灌注损伤可引起肠黏膜上皮细胞结构的破坏，导致肠黏膜通透性升高，进而损害肠黏膜的屏障功能，使肠腔内细菌穿过肠黏膜屏障到达其它器官定植和过度生长，引发感染，甚至出现系统性炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征(MODS)，严重者可危及生命。因此，探索减轻缺血再灌注引起的肠黏膜屏障损伤的有效治疗方法，具有重要的临床价值。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类存在于骨髓中的单个核样、具有多向分化潜能的非造血组织干细胞。在适宜的培养条件或局部微环境中，不仅能分化为中胚层来源的骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，还可向内胚层或外胚层的组织细胞分化。进一步的研究表明，MSCs不仅具有多向分化潜能，而且能分泌多种生物活性物质，可降低组织的炎症反应、抑制免疫反应;还能分泌多种生长因子促进受损组织细胞的增殖、分化、成熟，进而促进受损组织的修复。在本课题中，我们首先将MSCs通过直接注射的方式移植到I/R损伤的肠黏膜下，观察移植的细胞能否向肠黏膜内归巢及其归巢后的细胞动力学;在此基础上，探究 MSCs移植对I/R损伤后肠黏膜屏障功能的影响，并进一步探讨MSCs对I/R后肠屏障作用的可能机制;为MSCs治疗I/R肠屏障功能障碍的临床应用提供实验基础。全文共分三部分:　　第一部分MSCs向缺血再灌注损伤肠黏膜归巢及细胞动力学研究　　目的:观察外源性MSCs向缺血再灌注损伤肠黏膜归巢的规律及归巢细胞的分化和增殖。　　方法:用完全贴壁法分离、培养扩增雄性SD大鼠的MSCs，流式细胞仪鉴定表面抗原，并用BrdU标记。受体雌性SD大鼠剖腹采用夹闭肠系膜上动脉的方法建立缺血再灌注肠损伤模型。供体MSCs经小肠黏膜下直接注射移植，于移植后不同时间点取受体鼠小肠标本，通过SRY基因原位杂交和免疫组化方法检测外源性MSCs在受损肠黏膜的定植情况，并进一步通过SRY原位杂交和CK及PCNA免疫组化共染色方法检测供体来源的细胞在受体肠黏膜的分化和增殖。　　结果:完全贴壁法培养和CD90、CD45细胞表面抗原的流式细胞仪分选，成功进行了大鼠MSCs的分离、培养、扩增和鉴定;经肠黏膜下直接注射的移植方式可显著提高移植细胞向肠黏膜的归巢率，归巢的细胞在一周内到达高峰后开始下降，归巢的MSCs在肠黏膜中表达PCNA，并有少部分表达肠黏膜上皮细胞标志物—细胞角蛋白(CK)。　　结论:黏膜下直接注射的移植方式可提高MSCs向肠黏膜的归巢率，归巢的细胞能在肠黏膜内增殖并具有向肠黏膜细胞分化的潜能。　　第二部分MSCs减轻肠缺血再灌注损伤的实验研究　　目的:观察MSCs移植对缺血再灌注损伤后肠黏膜屏障功能的影响。　　方法:实验动物随机分为3组:A组（假手术组）:只行剖腹术和肠系膜上动脉的分离而不夹闭;B组(MSC移植组):受体雌性SD大鼠剖腹夹闭肠系膜上动脉45min后放开动脉夹，雄性SD大鼠的MSCs培养扩增到第三代后经小肠黏膜下直接注射移植;C组（生理盐水组）手术方法同B组，黏膜下注射等体积的生理盐水。于移植后不同时间点处死动物前6h用乳果糖/甘露醇混合液灌胃后收集尿液，高效液相色谱仪测定尿中L/M比值;取受体鼠肠系膜淋巴结行细菌培养，计数细菌易位发生率及易位的菌落数;取受体鼠回肠标本，用ELISA方法测定肠黏膜组织的TNF-α水平;进行黏膜组织病理学评分，并用分光光度法测血浆D-乳酸、DAO水平，透射电镜和免疫荧光观察肠上皮细胞紧密连接以评价MSCs移植对肠黏膜屏障功能的影响。结果:以A组动物的测定值为参照标准进行评估发现，B组动物的肠黏膜组织中TNF-α水平在移植后第4、7天均低于C组(P＜0.01)，组织损伤评分(Chiu score)亦明显低于C组(P＜0.05)、细菌易位发生率和平均易位的菌落数在移植后第7天也低于C组(P=0.02)，血浆D-乳酸和DAO水平B组较C组显著下降(P＜0.01);透射电镜和免疫荧光观察B组的肠黏膜细胞紧密连接相对于C组保持完整。　　结论:MSCs黏膜下移植后可显著降低肠黏膜组织中TNF-α的水平，减轻肠黏膜细胞的损害，降低I/R后肠黏膜的通透性、减少细菌易位的发生，说明MSCs移植能够减轻缺血再灌注对肠黏膜机械屏障的损伤。　　第三部分MSCs降低肠缺血再灌注损伤的可能机制研究　　目的:研究MSCs移植对肠I/R损伤后肠黏膜细胞PCNA、细胞增殖信号通路磷酸化ERK1/2及细胞内炎症信号通路NF-kB的表达变化。　　方法:取各组动物的回肠黏膜标本，提取黏膜组织RNA，用荧光实时定量PCR测定MSCs移植与对照组处理的肠黏膜组织PCNA mRNA表达的差异;并进一步提取细胞核蛋白，用蛋白免疫印迹(western-blot)方法检测PCNA在蛋白水平表达的差异。提取细胞总蛋白和核蛋白，检测不同处理因素对细胞增殖信号通路磷酸化ERK1/2及细胞内炎症信号通路NF-kB表达的影响。　　结果:肠缺血再灌注后第4天及第7天，MSCs移植组动物肠黏膜细胞PCNA表达无论在mRNA水平还是蛋白水平均高于生理盐水对照组(P＜0.01，P＜0.05)，细胞增殖信号通路—磷酸化的ERK1/2表达亦显著高于生理盐水组(P＜0.05)，而细胞内炎症信号通路NF-kB的表达则低于生理盐水对照组(P＜0.05，P＜0.01)。　　结论:MSCs移植能够减轻I/R对肠黏膜屏障的损伤，其机制可能是通过促进损伤后细胞的增殖和减轻细胞的炎症反应而实现。