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生物催化的不对称还原反应中，辅酶不能循环使用是限制其工业化应用的“瓶颈”因素。全细胞可以通过自身代谢为反应提供一定量的辅酶，但按照化学当量平衡，当底物浓度提高，反应所需的辅酶量增加时，辅酶的供给就成为主要的限制因素。本文根据大肠杆菌对密码子的偏好性，对近平滑假丝酵母(CandidaparapsilosisCCTCCM203011)的(R)-羟基苯乙酮还原酶基因rcr进行了密码子优化。用PCR的方法从博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)基因组中扩增出甲酸脱氢酶基因fdh，将两个基因克隆构建到共表达载体pETDuetTM-1后，转化稀有密码子优化型菌株EcoliRosetta，实现了(R)-羟基苯乙酮还原酶和甲酸脱氢酶基因的高效共表达。以高浓度(5g/L)的2-羟基苯乙酮和适量的甲酸钠为底物，0.1g重组菌细胞催化产生(R)-苯基乙二醇，进行了不对称还原反应条件的选择，为基因工程法生物合成(R)-苯基乙二醇的工业应用奠定了基础。主要研究结果包括：
(1)以实验室保藏的C.parapsilosis基因组为模板，根据(R)-羟基苯乙酮还原酶基因序列和大肠杆菌密码子的偏好性，设计引物Rcr-F1和Rcr-R1，Rcr-F2和Rcr-R2，以及Rcr-F3和Rcr-R2，用PCR的方法扩增出目的基因rcr的前半段(约800bp)和后半段(约200bp)，然后用重叠延伸PCR(splicingoverlappingextension-PCR，SOE-PCR)的方法连接两段基因获得密码子优化后的全长基因rcr。将rcr克隆到pMD19-T载体中，获得重组质粒T-rcr，测序结果表明rcr序列全长为1011bp，编码336个氨基酸。
(2)以实验室保藏的C.boidinii基因组为模板，根据已报道的C.boidinii的fdh基因序列(AccessionNo.AJ011046)，利用DNAMAN软件设计引物Fdh-F和Fdh-R，PCR法扩增出基因fdj后连接到pMD19-T载体中，获得重组质粒T-fdh，测序结果表明rcr基因全长为1095bp，编码364个氨基酸。
(3)将rcr与fdh基因同时构建到共表达质粒pETDuetTM-1中，获得重组质粒pETDuet-rcr-fdh。将重组表达质粒转化密码子优化型菌株E.coliRosseta，获得(R)-羟基苯乙酮还原酶和甲酸脱氢酶基因的共表达阳性克隆。经30℃，1mmol/LIPTG诱导8h，SDS-PAGE结果表明(R)-羟基苯乙酮还原酶和甲酸脱氢酶均有明显表达，其相对分子质量分别为37kDa和40kDa。通过摇瓶条件的研究,确定了重组蛋白的最佳诱导条件为：250mL的三角瓶中装液量20％，培养液的OD600值为0.8开始诱导，诱导温度为30℃，IPTG的浓度为0.8mmol/L，诱导16h结束培养。由于引物设计时插入了6×His标签，因而通过Ni2+离子柱亲和层析一步纯化，同时获得了较纯的两种酶蛋白。
(4)对重组菌全细胞催化2-羟基苯乙酮不对称还原反应的条件进行了选择，结果表明当底物2-羟基苯乙酮浓度为5g/L，细胞浓度为10％时，选择最适pH7.0，最适反应温度35℃，反应时间36-h，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度达到100％e.e.，产率可达74.0％。通过优化反应体系中辅助底物甲酸钠的浓度，并添加适量的ZnSO4，可使产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别达到100％e.e.和85.9％。