ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,简写ε-PL)是由25-35个L-赖氨酸通过α-羧基和ε-氨基缩合而成的一种同型氨基酸聚合物,主要由链霉菌属微生物经好氧发酵产生并在胞外积累。由于ε-PL具有广谱的抑菌活性和较高的食品安全性,目前被用作一种新型生物食品防腐剂,在日本、韩国、美国和中国的食品工业中获得批准使用。此外,ε-PL作为一种安全且环境友好的生物聚合物,在生物医药领域也有着广泛应用前景。因此,ε-PL是一种具有广泛应用领域和巨大市场价值的新型生物技术产品。论文以一株ε-PL工业生产菌株Streptomyces albulus M-Z18为研究对象,通过建立低pH冲击两阶段发酵策略,显著提高了低p H冲击工艺的ε-PL发酵效率;从生理水平和基因转录水平系统探究了低pH冲击对S.albulus M-Z18产生的影响;同时,通过基因失活、回补和过表达等分子操作,研究了S.albulus M-Z18响应低p H冲击的双组分系统MprAB的生理功能;最后,系统研究了S.albulus M-Z18耐受低pH环境胁迫的生理机制,并发现尿素酶系统在S.albulus M-Z18抵御低p H环境胁迫中起到重要作用。取得的主要研究结果如下:(1)建立了低pH冲击两阶段发酵策略,显著提高了ε-PL发酵效率。基于已有p H冲击工艺的发酵过程分析,发现了其生产强度低的原因;通过对接种时机、初始发酵pH和接种量的优化,建立了一种新型的低p H冲击两阶段发酵策略:第一阶段为种子培养阶段,包含种子生长、pH冲击和菌体恢复;第二阶段为恒定p H3.85发酵阶段。应用新策略,实现5 L发酵罐,ε-PL产量、ε-PL产率和转化率分别达到32.22 g/L、5.86 g/L/d和8.2%,较已有pH冲击工艺分别提高了55.12%、23.1%和43.9%。进一步放大至50 L发酵罐,实现ε-PL产量和DCW分别为31.26 g/L和45.68 g/L。(2)在生理水平研究了低pH冲击对S.albulus M-Z18的影响。通过菌体细胞生理参数分析,发现低p H冲击提高了ε-PL合成酶酶活并增加了胞内L-赖氨酸浓度;同时,低pH冲击通过增强细胞的呼吸活力提高了胞内ATP水平,这些参数均是影响ε-PL生物合成的关键要素;另外,低pH冲击降低了菌体细胞膜脂肪酸的碳链长度并增加了脂肪酸的不饱和度,从而提升了细胞膜流动性,有利于细胞内外物质运输;低pH冲击也引起了胞内活性氧水平增加但丙二醛含量较低,说明低pH冲击使得菌体细胞的抗氧化能力增强,这有利于菌体抵御后期长时间低pH的发酵环境。(3)在基因转录水平研究了低pH冲击对S.albulus M-Z18的影响。利用比较转录组学研究方法,发现低pH冲击引起了与信号转导、电子呼吸链、膜转运、氮代谢、能量代谢和氧化还原平衡等相关基因的转录水平显著变化,表明低p H冲击对S.albulus M-Z18造成了全局性的影响;同时,基因转录水平的变化也较好地印证了细胞生理参数的分析结果。(4)初步研究了双组份系统MprAB的生理功能。基于转录组学数据分析,发现低pH冲击引起双组份系统MprAB和丝氨酸蛋白酶PepD的编码基因转录量提高了2-5倍;通过进一步失活mprA、mprB和pepD,使得S.albulus M-Z18的ε-PL产量分别下降52.11%、60.56%和55.63%;再分别在三个突变株中回补三个基因,ε-PL产量均恢复到原始菌发酵水平;最后,在S.albulus M-Z18中分别进行三个基因的过表达,均显著提高了单位菌体ε-PL产量。上述研究结果表明,mprA、mprB和pepD对ε-PL合成酶基因(pls)具有正调控作用。另外,通过荧光定量PCR分析,发现Mpr B能够正调控Mpr A的表达,MprA与Pep D之间存在相关正调控关系。(5)系统研究了S.albulus M-Z18耐受低pH环境胁迫的生理机制。菌体胞内微环境参数分析发现,S.albulus M-Z18在低pH环境中(p H4.0),通过增加细胞膜脂肪酸不饱和度和平均碳链长度,提高H~+-ATPase活性和ATP水平,积累更多的精氨酸、赖氨酸和组氨酸等措施,维持胞内pH始终处于中性(p H 7.5);进一步的比较转录组学分析显示,在低pH环境中(pH 4.0),S.albulus M-Z18的糖酵解、TCA循环和氧化磷酸化途径得到强化,而大部分氨基酸合成途径被削弱,但天冬氨酸族氨基酸合成被加强;长链脂肪酸和不饱和脂肪酸合成能力也得到提高;同时,蛋白质修复与降解能力、DNA修复严重损伤能力均得到提高,这些发现与胞内微环境参数测定结果相一致。另外,通过构建耐酸系统基因敲除突变株,发现尿素酶系统在S.albulus M-Z18耐受低pH环境胁迫中起到重要作用。