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N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)是酶法合成N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的关键酶。在已确立的双酶法制备Neu5Ac方法中,大肠杆菌来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶(NAL)已经商品化;而来源于猪肾的AGE基因(age)在大肠杆菌中表达时,由于物种间差异,大部分形成包涵体,酶产量很低。因此,寻找高表达、高活性的AGE显得非常必要。本论文就是以此为对象,进行了以下研究:首先,对猪肾和鱼腥藻来源的AGE基因(age)进行了克隆和表达。通过RT-PCR、PCR方法,从两个物种中分别得到与已知基因序列完全一致的age基因。将两个基因分别克隆到表达载体pET30a上,构建成表达质粒pLY9和pLY11,并转入E.coli BL21(DE3)中进行了表达。其次,建立了HPLC柱前衍生化产物检测AGE酶活的方法。根据此方法的检测,在相同的培养诱导条件下,来源于鱼腥藻的AGE表达产量是猪肾来源的16倍。考察了鱼腥藻来源AGE的性质,结果显示该酶在pH8.0,温度40℃条件下活性最强。最后,利用表达的鱼腥藻源AGE与大肠杆菌源NAL,对双酶法制备Neu5Ac进行了研究。设计和研究了三种制备方式:(1)以pET30a为基础构建NAL和AGE双基因共表达基因工程菌,该基因工程菌可以同时产生NAL和AGE。实验证明,利用该方法制备的粗酶液具有NAL和AGE活性,并且可用来制备Neu5Ac。(2)利用分别诱导表达的E.coli BL21(DE3)/pLY3和E.coli BL21(DE3)/pLY11菌体进行双酶转化实验,结果转化产物Neu5Ac产量很低。(3)将分别诱导表达的工程菌破碎制备NAL和AGE粗酶液进行双酶转化实验,结果获得转化产物Neu5Ac。对该方法进行了转化条件优化,在考察了底物浓度,酶的比例、温度、反应pH、反应时间等因素后,获得的最佳转化条件为:丙酮酸钠250 mmol;N-乙酰-D-葡萄糖胺550mmol;NAL 1.28 U/ml;AGE 0.48 U/ml;pH 8.0;温度25℃;转化12 h。