[背景和目的]恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，传统的手术、放、化疗的疗效又不尽人意，这种局限决定了生物治疗必然要参与肿瘤的综合治疗，而肿瘤疫苗是肿瘤生物治疗的重要方法。目前常用的肿瘤疫苗传递方式分别以细胞、蛋白质、多肽、病毒载体为基础。树突细胞(Dendritic cells, DCs)是目前已知的抗原提呈功能最强的免疫细胞，将肿瘤相关抗原(Tumor-asscociated antigen, TAA)负载DC是目前常用的肿瘤免疫治疗的方式之一。但目前发现的肿瘤相关抗原大多具有组织特异性，如AFP只针对肝癌等，以这些抗原来进行免疫治疗，只能对相应的肿瘤起作用，限制了以这些抗原为靶标的肿瘤疫苗的广泛应用。寻找肿瘤特异性的共有抗原是肿瘤免疫治疗的关键问题。人端粒酶逆转录酶，又名人端粒酶催化亚单位，为端粒酶活性的限速成分，是癌细胞永生化的必要途径，在维持肿瘤继续分裂、增殖和生存中发挥重要作用。国内外许多研究表明，人端粒酶逆转录酶在85％以上的恶性肿瘤及其癌前病变中过度表达，其异常表达或激活是肿瘤形成的重要原因之一，新近研究报道人端粒酶逆转录酶的高表达也与肿瘤的不良预后、浸润转移均密切相关。我们过去的研究表明，带有hTERT全长基因的腺病毒载体负载DC，以及带有hTERT全长基因和隐性表位的颗粒疫苗，在体内外均可以诱导产生hTERT特异性的细胞毒T淋巴细胞(CTLs)，对hTERT阳性的胃癌、结肠癌等多种癌细胞具有一定的杀伤效应，而对表达hTERT阴性的淋巴细胞和DC不具有杀伤效应。与hTERT全基因序列腺病毒负载DC疫苗相比，多肽疫苗没有腺病毒载体的参与，不必考虑载体及其整合的安全性，也不必考虑全长蛋白中某些非优势表位或病理表位的毒副作用；而且，抗原肽长度仅8-15个左右的氨基酸序列，体外可以合成，临床应用前景更广阔。但多肽疫苗也常有其不足之处：最大的问题在于一个多肽疫苗只能代表一个表位，分子量小，结构单一，免疫原性较弱，在体内容易降解。为解决这一弊端，1988年Tam实验室提出了多抗原肽(Multiple antigen peptides,MAP)的设计方案，其聚赖氨酸核心构成一种十分紧密有序的树状结构，它在加强了抗原表位肽链结构特异性的同时，还增大其分子质量，不仅很好的模拟了天然表位的空间构象，而且还不需要再耦联载体蛋白就能诱导较强的免疫反应；同时，其稳定的二级结构不易反转，故降解速度减缓，延长抗原刺激时间，获得更好的杀伤活性。MAP疫苗的设计方案不仅适用于B细胞表位，同样也适用于T细胞表位。基于以上分析，本实验拟选取人端粒酶逆转录酶HLA-A2限制性CTL表位hTERT-540(ILAKFLHWL), hTERT-865(RLVDDFLLV) and hTERT-572Y(YLFFYRKSV)，构建其四分支多抗原肽，研究其在体外体内的抗肿瘤活性，并与携带hTERT全长基因腺病毒载体疫苗、单肽疫苗诱导的CTL活性进行对比，为hTERT的MAP疫苗抗肿瘤效应的临床应用提供理论依据。[方法]1、选取三条人端粒酶逆转录酶CTL表位［hTERT-540(ILAKFLHWL), hTERT-865(RLVDDFLLV) and hTERT-572Y (YLFFYRKSV)］设计其MAP结构，采用标准固相肽合成法(SPSS)合成其四分支肽；反相高压液相色谱仪(RP-HPLC)分析其纯度；液相色谱/质谱联用(LC/MS)检测多肽分子量。阴性肽选用人HIV病毒HLA-A2限制性表位(ILLEP VHGV)。2、按文献所述分离培养人外周血单个核细胞(PBMC)来源的树突细胞。采用光学显微镜观察其形态，并采用流式细胞术鉴定其细胞表型。然后将携带hTERT全长序列的腺病毒载体、人端粒酶逆转录酶MAP肽、及其对应单肽分别负载DC后，诱导产生人端粒酶逆转录酶特异性CTL。采用标准51Cr释放实验检测人端粒酶逆转录酶特异性CTL对不同肿瘤靶细胞[SW480结肠癌细胞(hTERT~+, HLA-A2~+)、KATO-Ⅲ胃癌细胞(hTERT~+, HLA-A2~+)、U2OS骨肉瘤细胞(hTERT-, HLA-A2~+),转染了人端粒酶逆转录酶cDNA的U2OS/hTERT骨肉瘤细胞(hTERT~+, HLA-A2~+), MCF-7乳腺癌细胞(hTERT~+, HLA-A2~+), HepG2肝癌细胞(hTERT~+, HLA-A2-),转染了HLA-A2cDNA的HepG2/HLA-A2肝癌细胞(hTERT~+, HLA-A2~+)的免疫杀伤活性；采取同样方法检测上述人端粒酶逆转录酶特异性CTL对低表达人端粒酶逆转录酶的自体淋巴细胞和树突细胞有无杀伤作用以研究其毒副作用；采用ELISPOT试验检测产IFN-γ效应细胞的数量。3、按文献所述分离培养C57BL/6-Tg(HLA-A2~+)小鼠骨髓来源的树突细胞(mDC)，采用光学显微镜观察其形态，采用流式细胞术鉴定其细胞表型。然后将携带hTERT全长序列的腺病毒载体、人端粒酶逆转录酶MAP肽、及其对应单肽分别负载mDC后，免疫小鼠，每周一次，共三次。最后一次免疫7天后取免疫小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞，51Cr释放实验检测人端粒酶逆转录酶特异性CTL对上述的肿瘤靶细胞以及自体淋巴细胞和树突状细胞有无杀伤效应；采用ELISPOT试验检测产IFN-γ效应细胞的数量。4、实验数据采用SPSS17.0统计软件进行t检验，当P﹤0.05时认为差异有统计学意义。［结果］1、通过反相高压液相色谱仪(RP-HPLC)检测合成的多抗原肽及对应单肽的纯度均在95%以上，达到国际多肽实验标准。液相色谱/质谱联用(LC/MS)检测合成的多抗原肽及对应单肽的分子量，结果表明所得肽的分子量理论值与实测值之间无明显差异，为我们所需的目的多肽。2、体外(In vitro)和离体(Ex vivo)实验均提示，携带全长hTERT序列的腺病毒载体、人端粒酶逆转录酶特异性CTL对于人端粒酶逆转录酶阳性且HLA-A2阳性的SW480、MCF-7、KATO-Ⅲ细胞具有明显的杀伤作用，且携带全长hTERT序列的腺病毒载体诱导的杀伤效应最强；人端粒酶逆转录酶MAP所诱导的杀伤效应明显高于其对应单肽诱导的杀伤效应；但对HLA-A2阳性但人端粒酶逆转录酶阴性的U2OS细胞或人端粒酶逆转录酶阳性但HLA-A2阴性的HepG2细胞均无杀伤效应，对人端粒酶逆转录酶阳性且HLA-A2.1匹配的U2OS/hTERT细胞和HepG2/HLA-A2.1细胞，提示该CTL反应具有人端粒酶逆转录酶特异性及HLA-A2限制性。同时本实验还发现，无论是人端粒酶逆转录酶MAP肽诱导的CTL，还是其对应单肽诱导的效应细胞对低表达人端粒酶逆转录酶的自体淋巴细胞和DC都不具有杀伤效应，提示人端粒酶逆转录酶MAP肽疫苗的安全性。通过ELISPOT试验检测产IFN-γ效应细胞的数量，结果显示携带全长hTERT序列的腺病毒载体可以诱导效应细胞释放最多IFN-γ；人端粒酶逆转录酶MAP肽较之其对应单肽可以诱导更多的效应细胞产生IFN-γ。但在去除CD4＋T淋巴细胞后，携带全长hTERT序列的腺病毒载体、人端粒酶逆转录酶MAP肽及其对应单肽诱导效应细胞分泌IFN-γ的水平均明显下降，提示CD4+T淋巴细胞在CD8+T淋巴细胞的免疫应答及应答维持中发挥重要作用。［结论］DC负载的HLA-A2限制性人端粒酶逆转录酶CTL表位MAP疫苗相较于其单肽能在体外体内诱导更强的抗肿瘤免疫效应。这种人端粒酶逆转录酶MAP疫苗具有高效、安全的特点，为人端粒酶逆转录酶MAP肽疫苗的临床应用提供了实验依据。