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急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种血液系统恶性肿瘤,缓解率较低,复发率高,5年总生存率仅约25%左右。抗凋亡蛋白Bcl-2的过表达与AML患者的整体生存率较低有关。Venetoclax（ABT199）)是一种选择性靶向Bcl-2的抑制剂,在AML中疗效显著,但单药常因Mcl-1蛋白的高表达而发生耐药。如何克服耐药,提高疗效成为临床亟待解决的问题。西达本胺（CS055）为我国自主研发的去乙酰化酶抑制剂,研究证实西达本胺能引起Bcl-2及Mcl-1表达水平的下调,诱导细胞凋亡,那么我们设想Venetoclax和西达本胺二者联合是否能协同抗AML白血病。本课题的研究目的旨在探讨Venetoclax和西达本胺联合抗白血病的作用和机制。主要从以下三个部分进行研究并发现:一,Venetoclax联合西达本胺对AML细胞系及原代细胞具有协同促凋亡作用;二,转录组测序并经RT-qPCR及Western blot验证发现西达本胺通过抑制PI3K/AKT通路和JAK2/STAT3通路的激活协同Venetoclax促进AML细胞凋亡;三,西达本胺联合Venetoclax较单药组可明显抑制异种移植AML模型鼠的肿瘤进展,显著延长小鼠生存期。本课题的研究成果为解决临床上Venetoclax耐药问题提供了新的策略和理论依据。第一部分 西达本胺和Venetoclax对急性髓系白血病细胞的协同促凋亡作用研究目的以AML细胞系（OCI-AML3、THP-1、MV4;11、MOLM13）和原代细胞为研究对象,观察Venetoclax联合西达本胺对AML细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。研究方法1.不同浓度的Venetoclax、西达本胺单药分别作用于AML细胞系24h、48h和72h,CCK法检测两药对四个细胞系的增殖抑制水平,并计算相应的IC50值。2.不同浓度的Venetoclax、西达本胺单药和联合用药分别作用于AML细胞系8h和24h,流式细胞术检测细胞凋亡,联合组计算CI值。3.不同浓度的Venetoclax、西达本胺单药和联合用药分别作用于AML原代细胞24h,流式细胞术检测细胞凋亡。4.不同浓度的Venetoclax、西达本胺单药和联合用药分别作用于AML细胞系24h,流式细胞术检测细胞周期和线粒体膜电位的变化。5.上述实验分别重复三次。统计分析采用SPSS22.0软件。研究结果1.Venetoclax、西达本胺单药均能抑制AML细胞系的增殖,具有时间和浓度依赖性。2.Venetoclax、西达本胺单药均能促进AML细胞系及原代细胞的凋亡,呈时间和浓度依赖性,两药联合促凋亡作用进一步增强,且具有协同促凋亡作用（CI＜1）。3.单药西达本胺可使AML细胞系的细胞周期阻滞在G1期,单药西达本胺及Venetoclax使原代细胞阻滞在S期;两药联合,该阻滞作用进一步加强。Venetoclax、西达本胺药均可降低AML细胞系的线粒体膜电位,两药联合此作用进一步增强。第二部分 西达本胺和Venetoclax对急性髓系白血病细胞协同促凋亡作用的机制研究研究目的研究西达本胺协同Venetocl ax促进AML细胞凋亡的作用机制。研究方法1.RT-qPCR和Western blot检测AML细胞系中Bcl-2、Mcl-1在mRNA水平和蛋白水平的表达。2.Venetoclax、西达本胺单药及联合作用于AML细胞系及原代细胞24h,RT-qPCR和Western blot检测凋亡相关分子mRNA水平和蛋白水平的表达变化。3.将最适浓度的Venetoclax、西达本胺单药及联合作用于Venetoclax耐药细胞系OCI-AML3 24h,进行转录组测序分析,筛选相关差异表达的基因,并进行KEGG通路富集。4.RT-qPCR和Western blot在mRNA和蛋白水平验证富集通路中差异分子的表达。5.上述实验分别重复三次。统计分析采用SPSS22.0软件。研究结果1.AML细胞系（OCI-AML3、THP-1、MV4;11、MOLM13）在mRNA和蛋白水平均表达Bcl-2、Mcl-1,AML细胞系对Venetoclax的IC50 值与Bcl-2、Mcl-1蛋白的表达水平无相关性（p＞0.05）。2.在mRNA水平Venetoclax、西达本胺单药组及联合组均可使Bcl-2、Bcl-xl表达量明显下降（p＜0.05）,Venetoclax上调Mcl-1表达,西达本胺下调Mcl-1表达,联合后Mcl-1表达量进一步下降（p＜0.05）。3.在蛋白水平Venetoclax、西达本胺联合组cf-caspase3、cf-PARP1、γH2AX、Bax/Bak的表达较对照组及单药组明显升高。西达本胺下调Bcl-2表达,两药联合后Bcl-2表达水平总体下降。Venetoclax上调Mcl-1表达,西达本胺下调Mcl-1表达,联合后Mcl-1表达量进一步下降。Venetoclax、西达本胺单药组Bim表达量均下降,两药联合后此作用进一步增强。4.Venetoclax和西达本胺单药均可显著上调P21基因及蛋白的表达,西达本胺下调CDK2及Myc基因及蛋白的表达,联合Venetoclax后该作用进一步增强。5.转录组测序发现Venetoclax单药组和联合组相比,差异表达的基因主要富集在PI3K-AKT通路和JAK2/STAT3通路。6.RT-qPCR及Western blot验证转录组测序结果:1).西达本胺下调AKT基因及P-AKT蛋白的表达,上调P21的表达,下调CDK2及Myc的表达。2).西达本胺上调SOCS3基因及蛋白的表达,下调Jak2基因及P-JAK2蛋白的表达,上调P21的表达,下调CDK2及C-myc的表达同时下调Bcl-2、Mcl-1的表达。3).西达本胺单药组及联合组上调了 HDAC1基因及蛋白的表达,上调P21表达水平。第三部分 西达本胺和Venetoclax对急性髓系白血病细胞协同促凋亡作用的体内研究研究目的建立AML异种移植模型鼠,体内观察西达本胺协同venetoclax抗AML白血病的作用。研究方法利用免疫缺陷鼠NSG建立AML异种移植小鼠模型,随机分为4组:对照组,venetoclax及西达本胺单药组及联合用药组,监测各组小鼠体重,活体成像观察体内肿瘤负荷变化,免疫组化检测AML细胞髓外浸润情况,观察小鼠生存期绘制生存曲线。研究结果西达本胺联合Venetoclax较单药组和对照组可显著抑制AML模型鼠的疾病进展,明显延长小鼠生存期。结论1.Venetoclax和西达本胺均抑制AML细胞的增殖,降低线粒体膜电位,协同促进AML细胞凋亡,并具有时间和浓度依赖性。2.西达本胺可能通过降低Mcl-1和Bcl-2的表达来发挥协同venetoclax促AML凋亡的作用。3.西达本胺联合Venetoclax可能通过使AML细胞系周期阻滞在G1期,原代细胞周期阻滞在S期抑制细胞增殖。4.西达本胺可能通过抑制PI3K-AKT信号通路关键分子AKT的表达,上调JAK2/STAT3通路关键分子SOCS3的表达,上调P21的表达,下调CDK2及Myc的表达,引起细胞周期阻滞,抑制细胞增殖。5.西达本胺可能通过上调HDAC1及去乙酰化H3蛋白的表达,增加组蛋白的乙酰化程度,通过上调P21基因水平,抑制细胞增殖。6.西达本胺联合Venetoclax可显著抑制AML异种移植小鼠肿瘤进展,延长小鼠生存期。