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特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是间质性肺疾患(Interstitial Lung Disease,ILD)中较为常见且病死率极高的一种临床类型。IPF的发病年龄多在60岁以上,男性患者较多,是一种典型的衰老相关性疾病。目前IPF的发病原因仍未阐明,除肺移植之外临床治疗尚无有效药物和干预手段,是医学临床亟待解决的重大课题之一。研究发现,近20%的IPF患者有家族史,称为家族性肺纤维化(Familial Pulmonary Fibrosis,FPF)。截止目前已发现多个基因的遗传性突变和功能异常与FPF的发病相关。文献资料显示,约18%的FPF患者携带端粒酶相关基因TERT或TERC的遗传性突变,而DKC1和RTEL1基因突变则可介导端粒维持障碍相关的IPF发生及其表型发展。此外,在部分FPF患者中还分析鉴定了肺泡表面活性物质相关基因SFTPC和SFTPA2的突变与FPF发病的关系。在无明确家族史的散发性IPF患者中,TERT及TERC突变的检出率仅1%-3%,而其它基因突变的检出率很低。因此,散发性IPF发病的遗传易感因素有待深入研究。一般认为,衰老过程中的氧化损伤是IPF的发病诱因之一。肺泡上皮细胞(Alveolar Epithelial Cells,AECs)的氧化损伤/凋亡可能是引发IPF发生的初始事件,并在疾病的发展中起到重要作用。本实验室前期工作中发现,中国人群中碱基切除修复基因家族中的MUTYH基因存在AluYb8插入多态性变异。MUTYH是细胞DNA氧化损伤修复的重要基因之一,AluYb8MUTYH插入变异与其携带者细胞中的线粒体基因组(Mitochondrial DNA,mtDNA)氧化损伤累积以及衰老相关性疾病的发病风险增高相关。结合学科的研究进展和本实验室前期的研究结果,本论文从IPF发病可疑易感基因分析、突变鉴定和IPF临床表型发展相关遗传学变异的功能意义两个方面探讨IPF的遗传学基础。第一部分:中国人ABCA3基因的胚系变异与特发性肺纤维化的遗传易感性研究ABCA3是AECs中高表达的一类脂质转运蛋白,属于ABC转运蛋白家族成员之一。ABCA3基因纯合型突变已被报道与新生儿呼吸窘迫症以及儿童型间质性肺炎相关。然而,ABCA3基因变异与成人ILD及散发性IPF发病风险之间的关系还鲜见报道。在这一部分的研究中,我们基于本实验室前期实施的10例散发性IPF患者外显子组测序信息,通过数据统计、Sanger测序确认和生物信息筛选,确定ABCA3基因做为分析靶,探讨ABCA3基因的胚系变异与散发性IPF遗传易感性的关系。我们首先采用直接测序技术,对比筛查了 30例散发性IPF患者和30例年龄性别匹配的健康对照的ABCA3基因全外显子序列。我们共在13/30的IPF患者中检测到11个位点的错义突变(均为杂合型),错义突变检出率显著高于对照人群(在2/30健康对照中检出2个位点的错义突变)。为进一步确认ABCA3基因的突变与IPF发病风险之间的关系,我们在对检出突变进行生物信息学分析的基础上,选择其中四个错义突变(p.L39V、p.V968M、p.S828F和p.G1205R)进行队列分析。我们采集了 1054例ILD患者,包括280例IPF患者和774例结缔组织病相关间质性肺疾病(Connective Tissue Disease Associated Interstitial Lung Disease,CTD-ILD)患者,及1084例健康对照的外周血细胞DNA,利用Taqman探针技术,在患者和对照中对比分析这4个变异的等位基因频率。结果显示,ABCA3基因错义突变p.G1205R在ILD(含IPF)患者中的等位基因频率显著高于健康对照,表明该变异可提高携带者ILD(含IPF)的发病风险。ABCA3 p.L39V的检出频率增高仅见于IPF患者,提示该变异仅与IPF的发病高风险相关联;而错义突变p.S828F和p.V968M在队列分析的患者和对照人群未有新的检出,提示这两个突变均为IPF患者中偶发的罕见变异,可能和患者的发病相关。综上结果,我们认为ABCA3基因的杂合型变异可能构成中国人IPF发生的遗传易感因素。第二部分:MUTYH基因AluYb8插入变异与特发性肺纤维化患者mtDNA失稳及与患者临床表型发展的关系研究本实验室前期工作发现,人类MUTYH基因第15内含子存在一个AluYb8插入的多态性变异—AluYb8MUTYH。依据AluYb8插入(Presence,P或Absence,A)状态,MUTYH基因在人群中分见3种基因型:纯和野生型(A/A),纯和插入型(P/P)和杂合型(A/P)。AluYb8MUTYH可以通过下调线粒体定位的MUTYH 1亚型蛋白的表达,从而影响携带者体细胞mtDNA的氧化损伤修复和mtDNA的含量,并与衰老相关性疾病的发病风险增高相关。IPF属衰老相关性疾病,患者体细胞线粒体功能状态可能影响IPF的表型发展和临床预后。为探讨IPF患者中AluYb8MUTYH变异与携带者体细胞mtDNA改变及与患者表型发展、临床预后的关系,我们对比分析了 IPF患者和健康对照AluYb8MUTYH基因型与个体血细胞中mtDNA含量、完整性,mtDNA编码基因转录表达,及线粒体增殖、自噬等相关基因表达的关系。病例采集及分析研究的内容包括:①采用实时定量PCR(qRT-PCR)技术对比分析了 206例IPF患者和206例匹配的健康对照外周血单个核细胞mtDNA含量及与个体携带的AluYb8MUTYH基因型之间的关系;②采用长片段定量PCR技术对比分析了 105例IPF患者和105例匹配健康对照血细胞mtDNA完整性及与个体携带的AluYb8MUTYH基因型之间的关系;③针对87例IPF患者和87例健康对照,对比分析AluYb8MAUTYH基因型与携带者mtDNA编码基因ATP6和COX2,线粒体生物合成和动力学相关基因POLG、MFN2和ATG7的转录表达之间的关系。④基于212例IPF患者的长期随访资料,分析比较了 AluYb8MUTYH不同基因型与IPF患者临床特征的关系。结果:①在健康对照中,MUTYH P/P基因型携带者细胞mtDNA含量显著低于A/A和A/P基因型个体,显示AluYb8的纯合插入损害了携带者细胞mtDNA的维持;而在IPF患者中,P/P基因型携带者细胞mtDNA含量却“逆向”增高,结合患者细胞MFN2和ATG7表达改变的分析结果,提示P/P基因型IPF患者细胞中线粒体融合上调、线粒体自噬功能下降,mtDNA含量的增高是细胞受损mtDNA清除障碍而导致受损mtDNA累积的结果。②长片段定量PCR分析结果显示,IPF患者中,A/A、A/P和P/P基因型细胞的核基因组(nDNA)扩增效率明显低于同基因型的健康对照,提示氧化压力增高导致的nDNA损伤增加及DNA氧化损伤修复的活跃;相似的趋势也见于相同基因型IPF患者与健康对照细胞的mtDNA长片段定量PCR分析结果。而在健康对照或IPF患者组内,MUTYH P/P基因型携带者细胞的mtDNA长片段扩增效率高于A/A和A/P基因型细胞,反映了AluYb8MUTYH变异选择性损害mtDNA氧化损伤修复,P/P基因型细胞mtDNA脱碱基(DNA)单链断裂的氧化损伤修复过程相对减少。③AluYb8MUTYH三种基因型IPF患者中肺功能检出结果未见明显差异,但长期随访资料显示,携带有AluYb8MUTYH的IPF患者(P/P基因型)与MUTYH A/A基因型的患者与比较,其发病年龄和死亡年龄明显偏低。综上,MUTYH基因AluYb8插入变异可导致IPF患者体细胞mtDNA稳定性降低,并影响IPF的临床发展和预后。