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TRPC4离子通道小分子调节剂的筛选目的瞬时感受器电位C离子通道(Transient Receptor Potential Canonical,TRPC channels)是一类可调节细胞内钙浓度的非特异性阳离子通道,在体内分布广泛,参与多种不同生理功能,包括对神经、心血管、消化、呼吸、内分泌和泌尿系统的调节。目前,针对TRPC特异性的小分子化合物较少,且特异性差。本研究中,旨在发现特异性好的TRPC4通道小分子调节剂,这对于研究TRPC4通道的生理功能,调节机理,以及临床应用都将起到很大的促进作用。方法1.化学合成:基于先导化合物ML401的母核结构,设计并化学合成了一系列1-H-苯并咪唑-2-胺类衍生物。2.PCR及突变制备TRPC4的突变体。3.钙成像检测:在细胞水平对这些化合物进行高通量筛选。4.膜片钳记录:某些对TRPC4具有较好的抑制活性的化合物以全细胞记录的方式进行进一步鉴别。结果1.设计合成了30个1-H-苯并咪唑‐2-胺类化合物。2.制备出TRPC4的突变体(TRPC4 G503L)。3.化合物21活性(IC50=0.65μM)显著优于阳性化合物ML401(IC50=1.05μM)。4.化合物G1224对配体激活TRPC4通道有明显的增强作用(EC50=0.78μM)。结论发现一系列对TRPC4有良好抑制效应的化合物,尤其是化合物G1224对配体激活TRPC4通道有显著的增强作用。TRPP2通道调节胆囊平滑肌收缩作用目的TRPP2属于瞬时受体电位(transient receptorpotential,TRP)通道超家族的成员之一,广泛分布于多种组织中,包括消化道的平滑肌。大量的证据表明TRPP2通道能够调控细胞内钙库的释放。然而,TRPP2在胆囊平滑肌收缩中的作用仍不清晰。在本研究中,我们探讨了TRPP2在豚鼠胆囊平滑肌收缩中的调节作用及其机制。方法1.胆囊平滑肌条的制备:CO2窒息法将豚鼠窒息处死,立即取出胆囊。去除脂肪和浆膜层后,将胆囊沿纵轴切成一个1.0×0.3厘米的肌条。每条平滑肌条放入已经饱和有混合氧气(95%O2和5%CO2)的Krebs液的组织浴槽中。2.胆囊平滑肌条张力检测:使用数据采集和分析系统(BL-420S)来记录和分析收缩张力功能。用不同的激动剂去检测胆囊收缩功能的变化。3.胆囊平滑肌钙离子成像实验:将TRPP2 si RNA转染到胆囊平滑肌中,利用Leica SP5激光共聚焦显微镜系统检测激动剂诱导的细胞内钙离子浓度的变化。4.胆囊平滑肌Western blot实验:使用anti-TRPP2检测豚鼠胆囊平滑肌中TRPP2的蛋白表达水平。结果1.通过TRPP2特异性的si RNA转染,可以使豚鼠胆囊平滑肌内TRPP2蛋白表达被抑制,同时显著减小了胆囊平滑肌中Ca2+的释放和Ca2+内流,同样也抑制了激动剂引起的胆囊平滑肌收缩。2.U73122、2APB和TG可以显著抑制由卡巴胆碱引起的胆囊平滑肌收缩,消除了在TRPP2敲除组和scramble si RNA对照组中卡巴胆碱诱导胆囊平滑肌肌条收缩的不同。结论TRPP2通道介导了胆囊平滑肌细胞内钙库中Ca2+释放,并在激动剂诱导的胆囊平滑肌收缩中起着十分重要的作用。