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目的通过超声二维斑点追踪技术、组织多普勒技术、western blot和蛋白组学实验技术观察白马合剂对AS大鼠血脂水平、心功能、血流动力学及对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉蛋白组的影响,研究白马合剂抗AS的作用及机制。方法将体重为200±20克,3-4月龄健康纯种SD雄性大白鼠60只,随机分为正常对照组、空白模型组、葱白组、马齿苋组、白马合剂组和普罗布考组6组,每组10只。参照郭延松等的方法制备动脉粥样硬化模型：适应性喂养一周后,正常对照组喂基础饲料和普通自来水,模型组及各治疗组以高脂饲料并于实验开始时于右下肢肌肉注射维生素D3针剂(3×105u/kg体重),以后每隔30天重复注射一次。于第7天除正常对照组外,其余各组行大鼠主动脉内膜球囊损伤术,各组于手术后第3天开始给药,给药体积为10ml/kg,正常对照组和空白模型组给予生理盐水；葱白提取物组按60mg·kg-1给药；马齿苋提取物组按30mg·kg-1给药；白马合剂组按10m1·kg-1给药；普罗布考组按16mg·kg-1给药。每日1次,连续给药16周。观察动物的一般状态：观察动物的饮食、精神、体重、毛发、大小便及死亡情况；于实验16周末禁食16h后,取血5ml留置2管,分别分离血清和血浆,检测血浆TC、TG、HDL-C、LDL-C。观察动物心功能的改变：GE Vivid 7 Dimension彩色超声诊断仪,10S探头,探头频率为8MHz。探头置于左胸,在取得满意的胸骨旁左室长轴和短轴二维图像后,将图像储存到光盘上,以便进一步脱机分析。获取连续3个心动周期的胸骨旁左室长轴及乳头肌水平短轴切面时应该注意内膜显示清晰,且帧频大于190。进入EchoPAC工作站,于胸骨旁左室长轴切面使用M型超声测量左心室舒张末期内径(LVIDd)和收缩末期内径(LVIDs),计算左心室缩短率(FS)、射血分数(EF)。进入二维应变软件程序二维应变界面中,在收缩末期心内膜显示最清晰时将图像冻结,沿心内膜边界手动勾画,将自动生成包含心肌内膜、中层和心外膜的感兴趣区(region of interest, ROI),获得理想的追踪节段后,可自动显示左心室乳头肌短轴6个节段的应变曲线图。记录节段心肌的收缩期峰值径向应变(RS)和收缩期峰值环向应变(CS)。计算二尖瓣舒张早期血流峰值流速(E峰)与舒张晚期血流峰值流速(A峰)的比值E/A。颈动脉斑块血流动力学：GE Vivid 7彩色超声诊断仪,1OL探头,探头频率为13.OMHz。固定大鼠后,检测大鼠左侧颈总动脉,分别于颈总动脉近、中、远段三处测量血管内径,并在二维实时状态下将取样容积置于血管中心,调整最佳取样容积,使超声束与血流方向夹角小于60。.在连续观察数个心动周期后,获得最清晰血流速度频谱曲线冻结图像。依次测量血流速度、阻力指数(RI)及脉动指数(PI)。蛋白组学研究：实验结束后,分离腹主动脉,用GE healthcare双向电泳和质谱鉴定进行差异蛋白的检测。准备好所需的仪器和试剂后,按照下列顺序进行实验检测：动物组织蛋白提取与纯化→等电聚焦(蛋白溶解→定量→上样→干胶条泡胀→等电聚焦→胶条保存)→二向SDS-PAGE(灌胶→胶条平衡→二向电泳)→染色(凝胶转移→银染→考染→凝胶保存)→图像分析(凝胶扫描→图片挑选及裁切→图谱分析)→质谱前处理(挖点→脱色→酶切→肽段浓缩除盐)→质谱检测(点样→质谱分析→数据库检索)。最后进行质谱鉴定。结果大鼠的一般状态：适应性喂养一周后,除正常对照组饮食逐渐增加外高脂饲料组饮食逐渐减少,空白模型组减少最为显著,和正常对照组比较差异显著(P<0.01)；给药一周后,模型组和各药物组大鼠精神萎靡不振,活动度明显减少,模型组精神状态最差,葱白提取物组相对精神状态较佳；和造模前比较,喂养4周后,正常对照组体重增加最多,其余各组体重增加幅度小于正常对照组；造模给药后一周,大鼠粪便稀薄,小便色黄量少,以后逐渐变干；除正常对照组毛发光亮外,造模后各组大鼠毛发干枯,没有光泽；除正常对照组外,各组大鼠均有死亡,死亡动物均表现为：体重明显减轻、皮毛干枯、精神极度萎靡、行动迟缓,死亡后体检未见明显异常。对TC和TG的影响：与正常对照组比较,模型组大鼠TC、TG明显升高(P<0.01)；与空白模型组比较,除普罗布考组可以明显降低TG外(P<0.01),其余各治疗组均有降低TC和TG的作用,但无统计学差异(P>0.05)。对HDL-C、LDL-C的影响：与正常对照组比较,模型组大鼠HDL-C水平未见明显改变,LDL-C水平明显升高(P<0.01)；与空白模型组比较,马齿苋组LDL-C明显降低(P<0.01)。对心功能的影响：与正常组比较,空白模型组LVIDd未见明显改变(P>0.05), EF、FS、Em/Am值明显降低(P<0.05,P<0.01)；与模型组比较,各组LVIDd和FS值未见明显改变(P>0.05)。各组EF值升高明显(P<0.01)。葱白提取物Em/Am值升高明显(P<0.01),而其余各组Em/Am值未见明显改变(P>0.05)；白马合剂组与葱白提取物组比较,EF没有显著差异(P>0.05)；白马合剂组与马齿苋提取物和普罗布考组比较,组间没有显著差异(P>0.05)。对颈动脉血流动力学的影响：与正常组比较,模型组血流速度减慢(P<0.01),RI升高(P<0.01),PI降低(P<0.01)；葱白提取物组和普罗布考组血流速度加快(P<0.01,P<0.05),马齿苋提取物组和白马合剂组血流速度没有统计学意义(P>0.05)；各组均可降低RI(P<0.01),升高PI(P<0.01),普罗布考组作用最好,其次是葱白提取物组,再次是马齿苋提取物组,白马合剂组最差。对腹主动脉蛋白组的影响：将白马合剂组与空白模型组腹主动脉组织蛋白进行2-DE分离各重复3次。应用ImageMaster软件对2-DE凝胶图进行分析,选取空白模型组的腹主动脉图谱为Master,白马合剂组图谱与之进行比较,发现两组的胶条有较好的重复性,测得白马合剂组肌组织和空白模型组凝胶的平均蛋白质点数分别为330±11和325±9,匹配率为89%。研究发现有66个蛋白质斑点在2组凝胶中有显著差异表达(表达量相差2倍以上者),其中蛋白点表达量上升32个,34个蛋白点表达量下降。我们用ABI4700 MALDI-TOF-TOF质谱仪进行质谱分析,将提取出来的各组腹主动脉蛋白进行质谱鉴定,然后对各鉴定的蛋白进行了数据库搜索得到鉴定蛋白点的信息,发现这些蛋白主要包括主要急性期蛋白光蛋白聚糖前体、大鼠alphal巨球蛋白受体结晶体A链、结蛋白等,表达量降低的蛋白质斑点有5个,这些蛋白主要包括肌球蛋白重链2、血清白蛋白前体等。证明差异蛋白的表达与AS密切相关。结论1.白马合剂可以降低AS大鼠TC、TG、LDL-C水平,升高HDL-C,对脂质代谢具有一定的调节作用。2.白马合剂组对AS大鼠EF、FS、E/A的影响,与葱白提取物组、普罗布考组和马齿苋提取物组未见明显差异。3.对AS大鼠血流动力学的影响,葱白提取物作用最强,白马合剂配伍后却没有明显的优势,可能与葱白提取物良好的辛温通阳的作用有关,和马齿苋配伍后并没有增效。4.大鼠腹主动脉2-DE图谱差异蛋白点的筛选与鉴定发现,白马合剂组和模型组比较有23个差异蛋白,并进行了鉴定,证明这些蛋白均与AS发生发展密切相关,白马合剂具有抗AS的作用。