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胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是成人中枢神经系统中常见的神经上皮肿瘤,被世界卫生组织(WHO)归类为Ⅳ级胶质瘤,是恶性程度最高的原发性脑肿瘤也是最致命的实体瘤。胶质母细胞瘤患者的预后极差,一般确诊后的中位生存期仅为14个月。对于大多数患者其发病原因不详,虽然目前外科手术、放疗以及化疗等医学手段取得了很大的进展,但仍不能有效改善患者的生存期。胶质母细胞瘤病人的5年生存率仅为5.1%,因此迫切需要筛选鉴定出有效的生物标记物,探索出胶质母细胞瘤的治疗靶标并阐明胶质母细胞瘤的发病机理,以确保GBM患者能够长期的生存。CBX3又称HP1γ,是异染色质蛋白1(HP1)家族的核心成员,是一类高度保守的多功能蛋白。其在结构上包含一个可以特异性识别H3K9me2/3位点的CD结构域(Chromodomain),所以CBX3也被称为组蛋白甲基化的阅读器,行使转录沉默的功能。根据研究表明目前CBX3已经在多种类型肿瘤的发生发展中具有重要作用,包括结直肠癌,胰腺癌,肺癌以及肝细胞癌等,但是在胶质母细胞瘤中有关CBX3的生物学作用以及分子调控机制还未有报道。我们在本篇论文中将利用分子病理学与分子生物学等实验手段来着重探索CBX3在胶质母细胞瘤细胞增殖,迁移侵袭以及肿瘤生成中的精细调控机制,为胶质母细胞瘤的靶向治疗提供新的诊断思路。主要取得的研究结果如下:(1)高表达的CBX3与胶质母细胞瘤患者不良预后相关为了确定CBX3在胶质母细胞瘤中扮演的角色,我们通过在线的R2临床数据库分析发现当CBX3高表达时,患者的生存率低预后差。并且分析了CBX3与胶质瘤的恶性分级之间的关系,发现胶质瘤的恶性级别越高,CBX3的表达越高。这暗示着CBX3可能在胶质母细胞瘤中扮演着致癌基因的角色。我们检测了CBX3在正常星形胶质细胞和胶质母细胞瘤细胞系中CBX3的mRNA和蛋白水平的表达,结果发现CBX3在胶质母细胞瘤的表达显著高于正常的星形胶质细胞。我们进一步通过免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹检测发现了肿瘤组织样本中的CBX3的表达量显著高于瘤旁正常组织样本。综上所述CBX3确实在胶质母细胞瘤中高表达并且与患者的预后密切相关,这也暗示着高表达的CBX3可以作为胶质母细胞瘤患者不良预后的指标。(2)CBX3调控胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移侵袭与肿瘤生成能力为了探索CBX3在胶质母细胞瘤增殖方面的影响,我们通过慢病毒介导的RNAi技术在LN229和U-87 MG细胞中干涉CBX3的表达,通过MTT和BrdU实验检测到细胞的增殖明显减慢。通过流式细胞仪检测了在干涉CBX3后细胞的周期进程,发现在干涉CBX3后细胞阻滞在S期。并在下调CBX3后检测相关周期蛋白的表达情况,结果发现与S期进程相关的周期蛋白发生显著变化。我们通过Soft agar、皮下成瘤和原位成瘤检测在干涉CBX3后显著抑制了胶质母细胞瘤细胞的体内外成瘤能力。为了研究CBX3在胶质母细胞瘤迁移侵袭的影响,我们在LN229和U-87 MG细胞中干涉CBX3通过Transwell和划痕实验检测发现细胞的迁移能力明显减弱。并且我们检测了相关细胞间充质标记物(N-cadherin,β-catenin,Slug,MMP13)的表达,在干涉CBX3后其表达都是显著性下调。我们为了确认干涉CBX3后抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖不是由于脱靶原因引起,所以我们在LN229和U-87 MG细胞中恢复CBX3表达能挽救由干涉CBX3引起的细胞增殖、迁移侵袭和成瘤的抑制作用。以上结果表明了CBX3对于胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移侵袭和肿瘤生成能力起重要作用。(3)CBX3对EGFR信号通路的调控机制EGFR在胶质母细胞瘤中高表达,并且EGFR所介导的下游信号通路对肿瘤细胞的增殖和迁移侵袭具有重要作用。为了进一步探讨CBX3对EGFR是否具有调控作用,我们首先干涉CBX3后检测到EGFR的表达显著下调,但是其mRNA水平没有发生变化。我们通过在GBM细胞中过表达CBX3后再添加EGFR抑制剂厄洛替尼(Erlotinib)检测发现可以抑制由过表达CBX3对细胞增殖以及迁移侵袭的促进作用,并且发现过表达CBX3能够引起EGFR以及下游通路的激活,添加厄洛替尼后能有效的抑制CBX3所引起的EGFR信号通路的激活。由于CBX3干涉后EGFR的mRNA水平并未由明显变化,所以我们猜测是CBX3从转录后水平上调控EGFR的表达,所以我们通过添加蛋白酶抑制剂(MG132)以及蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)和体外的泛素化实验明确了CBX3是通过调控EGFR的泛素化维持其稳定性的。我们接下来通过在线R2数据库分析得到EGFR的E3连接酶PARK2于STUB1与CBX3呈负相关,相关指数分别为-0.467和-0.336。我们进一步通过ChIP检测发现CBX3富集在PARK2和STUB1的启动子区域的33bp/261bp和-452bp/-211bp。接下来我们通过co-IP实验检测了CBX3与PARK2和STUB1之间是否存在蛋白互作,结果发现CBX3与PARK2之间存在蛋白结合,与STUB1蛋白之间没有互作。然后我们检测了CBX3与PARK2之间的互作对PARK2的影响,我们通过添加了蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)和体外泛素化实验,结果发现CBX3与PARK2的互作也起到调节PARK2蛋白的泛素化降解水平。我们通过双干涉(shCBX3/shPARK2和shCBX3/shSTUB1)体内外实验检测到双干涉能部分恢复由干涉CBX3对胶质母细胞瘤发生发展的抑制作用。验证了PARK2与STUB1是CBX3的下游效应因子。综上实验结果表明CBX3是通过调节STUB1与PARK2的表达进而保护EGFR的稳定性进而来稳定激活EGFR介导的信号通路。通过上述我们的实验结果,我们找到了CBX3调控胶质母细胞瘤进程的精确调控机制,CBX3不仅可以转录抑制EGFR的E3泛素连接酶PARK2与STUB1的表达来保护EGFR的稳定性,CBX3还可以通过与PARK2相互作用来调节PARK2泛素化降解进一步保护EGFR的稳定性。综上CBX3促进保护EGFR的稳定性,然后EGFR通过其下游信号通路来加速重要的细胞进程,例如细胞增殖以及迁移侵袭等。