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目的：探讨5-氮胞苷诱导人脐带间质干细胞(human umbilical cordmesenchyrmal stem cells,hucMSCs)体外向心肌样细胞分化的生物学特点,并初步揭示诱导分化的可能机制。
方法：采用组织块贴壁培养法分离培养hucMSCs。体外经5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-Aza)诱导第2代hucMSCs向心肌样分化；通过透射电镜、RT-PCR、免疫组化、实时荧光定量RT-PCR及Western blot等方法鉴定心肌样细胞的超微结构,心肌特异性基因及蛋白表达,干细胞标志变化等。采用Western blot方法分析诱导分化过程中ERK及PKC相关信号分子通路的变化并用相应抑制剂阻断信号分子通路,进一步观察5-Aza诱导后hucMSCs中基因及蛋白的表达变化。
结果：经5-Aza体外诱导hucMSCs向心肌样细胞分化,RT-PCR显示诱导组细胞结蛋白(desmin)表达显著增加并表达心肌特异性标志如β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain)、心肌钙蛋白T(cardiac troponinT)、心钠素(A—type natriuretic peptide)、Nkx2.5,免疫组化呈结蛋白、心肌钙蛋白强阳性；在透射电镜下,诱导后细胞具有条索状肌丝形成。实时荧光定量RT—PCR及Western blot显示干细胞标志物Nanog、Oct4、Sox2、Sall4在5-Aza诱导后的hucMSCs中mRNA及蛋白水平均显著下降。随诱导时间延长,诱导后hucMSCs中ERK磷酸化水平逐渐增加,而PKC无明显变化。使用MEK通路抑制剂U0126作用后,诱导后hucMSCs产生的相关心肌特异性基因及蛋白表达显著减少,且STAT3磷酸化水平及MEF-2c、MyoD的蛋白表达明显受到抑制。5-Aza诱导人肺成纤维细胞(human diploid lung fibroblasts,HFL1)两周后不表达心肌相关及特异性基因,且5-Aza不能诱导hucMSCs向成骨细胞分化。
结论：人脐带间质干细胞体外经5-Aza诱导可定向分化为心肌样细胞,其分化机制可能与ERK磷酸化有关,为应用hucMSCs治疗心肌损伤提供了理论依据和实验基础。