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目的:制备粒细胞样髓源性抑制细胞(granulocytic myeloid-derived suppressor cells,G-MDSCs)来源的外泌体(exosomes),观察G-MDSCs来源的exosomes(G-exosomes)对小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)发生发展的影响,研究G-exosomes对调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)的调控作用及其可能的机制。方法(1)小鼠右下腹皮下注射2×10~6个Lewis肺癌细胞,构建肺癌移植瘤模型。磁珠分选荷瘤小鼠脾脏中的G-MDSCs,于含10%超离胎牛血清培养液中培养16-20小时,收集培养上清。超速离心法联合外泌体提取试剂盒制备G-exosomes。利用Western blot检测G-exosomes表面分子,透射电子显微镜观察G-exosomes的形态,纳米颗粒追踪分析检测G-exosomes粒径大小。(2)将牛II型胶原(C-II)与弗氏完全佐剂1:1混合,充分研磨至油包水乳化物,取100μg乳化物于小鼠尾根部皮内注射,初次免疫当日为第0天;第21天,将C-II和弗氏不完全佐剂的乳化物再次免疫小鼠,构建CIA模型。在建模期间,第18天及第24天分别通过尾静脉注射100μg G-exosomes。在小鼠发病过程中,观察小鼠发病进程,包括平均关节炎指数(mean arthritis index,MAI)、CIA发病率等;第42天处死小鼠,取足趾关节制作病理切片,HE染色,显微镜下观察关节完整性、炎性细胞浸润等情况;利用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测小鼠淋巴结及脾脏中调节性B细胞、调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)、浆细胞(plasma cell)、滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell,Tfh)比例的变化;酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠血清中抗体水平变化。(3)磁珠分选小鼠脾脏B细胞,按2×10~6/孔接种于24孔板,分别加入PBS、G-exosomes(60μg/m L)、LPS(10μg/mL)、LPS(10μg/mL)联合G-exosomes(60μg/m L),利用FCM检测Breg细胞比例的变化;利用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,qRT-PCR)检测B细胞中IL-10mRNA水平变化;利用Western blot检测GSK-3β表达水平、GSK-3β磷酸化水平和CREB磷酸化水平的变化。结果(1)磁珠分选的G-MDSCs细胞纯度>95%;G-exosomes表达CD63而不表达calnexin,G-MDSCs细胞表达calnexin而不表达CD63;通过透射电子显微镜观察到G-exosomes为圆形或椭圆形的囊状结构,有完整的包膜;纳米颗粒追踪分析显示G-exosomes的粒径分布峰在100nm。(2)与CIA对照组小鼠相比,G-exosomes组小鼠足趾关节红肿不明显,活动障碍程度不高,平均关节炎指数较低,关节间隙正常,关节滑膜部位有少量炎性细胞浸润。造模第42天处死小鼠,G-exosomes组小鼠淋巴结中Breg细胞比例升高(P<0.05),而脾脏中Breg细胞比例无明显变化;G-exosomes组小鼠淋巴结及脾脏中Treg细胞比例均无明显变化;G-exosomes组小鼠淋巴结中浆细胞比例降低(P<0.05),而脾脏中细胞比例无明显变化(P>0.05);G-exosomes组小鼠淋巴结与脾脏中Tfh细胞比例均降低(P<0.05);ELISA检测结果显示小鼠血清中抗体水平明显降低(P<0.05)。(3)在体外,与PBS处理组Breg细胞比例相比,G-exosomes单独处理组Breg细胞比例出现升高趋势;LPS联合G-exosomes处理组Breg细胞比例高于LPS处理组(P<0.05);LPS联合G-exosomes处理组B细胞中IL-10mRNA水平明显高于LPS处理组(P<0.001);LPS联合G-exosomes处理组B细胞中GSK-3β磷酸化水平、CREB磷酸化水平明显高于LPS处理组。结论(1)G-exosomes明显减轻CIA疾病进程,这种作用可能与体内Breg细胞的比例增加、浆细胞与Tfh细胞的比例降低、血清中抗体水平降低有关。(2)G-exosomes体外能够增加Breg细胞比例,其作用可能与GSK-3β磷酸化水平、CREB磷酸化水平上调有关。