【背景】胰腺癌是一种恶性程度高、进展迅速和预后极差的消化系统常见恶性肿瘤。尽管新辅助化疗、外科手术技术、围手术期护理技术已取得显著进步,但是胰腺癌的预后并没有明显改善。在过去的几十年中,科研工作者一直致力于寻找胰腺癌发生发展的相关基因和分子通路,对于阐明胰腺癌发病机制、改善胰腺癌患者生存与预后具有重要意义。Gankyrin是在肝癌中发现的一个新的癌基因,定位于人类X染色体22区3带,编码一个包含七个锚蛋白重复序列的癌蛋白,其在所有物种中均高度保守。Gankyrin蛋白在正常消化系统器官呈阴性或仅有微弱表达,但是在癌变组织如肝细胞癌、食管鳞状细胞癌、结肠癌中异常高表达。Gankyrin是26S蛋白酶体的一个亚基,能与E3泛素连接酶MDM2结合,促进泛素化,负性调节P53基因;Gankyrin还可以与Rb结合,促进Rb蛋白磷酸化和降解,同时,Gankyrin还能与周期素依赖性蛋白激酶4结合,形成gankyrin-CDK4-cyclin D复合物,间接活化CDK4,使Rb蛋白高度磷酸化,增强E2F转录子活性,促进细胞周期G1/S进展,从而促进肿瘤发生和增殖。既往研究显示,Gankyrin的异常高表达在肝癌发生早期发挥着重要的作用,并与肝细胞细胞周期进展和暴发性肝功能衰竭中的肝再生密切相关。在食管鳞状细胞癌,Gankyrin的高表达预示着预后不良。我们实验室前期研究发现Gankyrin的高表达与结直肠癌的恶性表型正相关。这些结果提示Gankyrin可能是肿瘤发生发展过程中的重要相关分子。但其在胰腺癌组织的分布及其作用目前未见报道。【目的】1.检测Gankyrin在胰腺癌组织和胰腺癌细胞系中的表达及意义。2.观察Gankyrin对胰腺癌细胞增殖能力的影响。3.探讨Gankyrin影响胰腺癌细胞增殖的可能分子机制。【方法】1.免疫组化和Western blot法检测Gankyrin在胰腺癌和癌旁正常组织中的表达,并分析其临床病理学意义。2. Real-time PCR和Western blot检测胰腺癌细胞系(SW1990、PC-2、BxPC-3和PANC-1)中Gankyrin的mRNA和蛋白的表达。3.脂质体法将Gankyrin特异siRNA载体转染入胰腺癌SW1990细胞,将Gankyrin基因的真核表达载体转染入PC-2细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。4. MTT实验、软琼脂集落形成实验、流式细胞术等观察Gankyrin对转染细胞体外生长增殖能力的影响。5.裸鼠成瘤实验检测Gankyrin表达改变后,胰腺癌细胞的体内成瘤能力的变化。6. Western blot检测上述转染细胞中细胞周期相关分子cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4、PCNA、Rb、p-Rb、p27和p53的变化。【结果】1. Gankyrin在胰腺癌组织和胰腺癌细胞系中的表达。Gankyrin在癌旁组织的表达阳性率为7.8%(5/64),而在胰腺癌组织的表达阳性率71.9%(46/64),明显高于癌旁组织(P<0.01)。在癌组织中,低分化级别组Gankyrin的表达明显高于高分化级别组(P<0.05),TNM分期中低级别组Gankyrin的表达明显高于高级别组(P<0.05),Gankyrin的过表达与肿瘤大小密切相关(P<0.05)。各胰腺癌细胞系(SW1990、PC-2、BxPC-3和PANC-1)均有表达Gankyrin,其中SW1990表达水平最高,PC-2最低。2. Gankyrin对胰腺癌细胞体内外生长增殖能力的影响。转染Gankyrin正义载体的胰腺癌PC-2细胞较亲本细胞,生长速度显著加快,G1期进入S期的细胞比例增加,单细胞集落形成能力及裸鼠体内成瘤能力显著增强;而转染Gankyrin特异siRNA的胰腺癌SW1990细胞较亲本细胞,生长显著受到抑制,G1期进入S期的细胞比例明显降低,单细胞集落形成能力减弱,裸鼠体内成瘤能力也显著减弱。3. Gankyrin对参与细胞周期调节的相关分子的影响。转染Gankyrin正义载体的PC-2细胞中,参与细胞周期调节的相关分子cyclin D1、cyclin E、cyclin A、CDK2、CDK4、PCNA和p-Rb表达上调,p53、p27和Rb表达受到抑制。而siRNA下调SW1990细胞Gankyrin的表达后,cyclin D1、cyclin E、cyclin A、CDK2、CDK4、PCNA和p-Rb表达亦显著下调,p53、p27和Rb表达升高。【结论】1.胰腺癌组织Gankyrin的表达明显高于癌旁组织,Gankyrin在胰腺癌中的过度表达与其恶性进展密切相关。2. Gankyrin可以促进胰腺癌细胞在体内和体外生长增殖。3. Gankyrin至少部分通过调节细胞周期相关分子,促进细胞周期G1/S进展,从而影响胰腺癌细胞的生长增殖能力。