小麦全长cDNA pool的制备和低亲和性离子转运蛋白LCT1基因及剪接变异体的克隆及在烟草中的表达

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小麦是世界重要的粮食作物之一。cDNA文库是小麦功能基因组研究的重要组成部分,小麦的全长cDNA文库的构建可以为小麦基因组计划的研究提供重要的技术支撑,是小麦物理图谱的绘制、基因识别、结构及功能研究、表达及定位的重要依据之一。而全长cDNA池(full-length cDNA pool)则是cDNA文库构建的最重要环节。 我们采用改进的GeneRacer技术获得了全长cDNA池,其原理是基于效率较高的oligo-caping方法。制备好的全长cDNA池,和特定克隆载体DNA连接,转化宿主菌,随机挑取阳性克隆进行测序分析,所得序列的全长性也证实了该方法的可靠性。经检验该全长cDNA池的质量较高,可用于构建全长cDNA文库。 Daniel等人通过基因功能互补法从小麦根组织中分离的LCT1基因,可编码包含574个氨基酸的低亲和性离子通道蛋白。其二级结构分析显示:该蛋白包含8到10个跨膜螺旋和1个富含Pro、Ser、Thr和Glu的(PEST序列)亲水性氨基酸端。通过在k+吸收缺陷型酵母G19中表达LCT1 cDNA发现LCT1表达的蛋白是渗透型广范围离子通道,它能低亲和性调节Li+、Na+、K+、Rb+、Ca2+等离子的单向吸收,离子吸收率与离子浓度成线性关系。高浓度K+、Cs+、Ca2+的竞争性的抑制可降低对Na+的吸收,从而改善Na+引起的毒性,挽救盐培养基上酵母的生长。 在特定酵母中过量表达LCT1基因时可导致Na+、K+等多种离子通透性的增强,而对它在植物中的研究却较少。为了研究植物在盐胁迫对下LCT1基因的作用,寻找小麦抗盐育种的新途径,我们从全长cDNA pool中钓取该基因,并发现了一种缺少115bp片断的LCT1 cDNA克隆,通过从小麦基因组中克隆其基因组序列,三者比较分析发现,缺少115bp片断的LCT1 cDNA为组成性剪接的产物(因为来源于2号克隆菌,命名为LCT1-2),已报道的LCT1 cDNA则是第四个内含子保留的选择性剪接产物。 将这两个cDNA序列分别构建到植物表达载体中并转化烟草,结果表明转LCT1基因的烟草在正常培养基1/2MS中生长缓慢,且不生根。它与转LCT1-2基因的烟草在可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量上比对照K326明显偏高,可
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