Cu²⁺是植物生长和发育过程中必须的微量元素,是细胞内许多酶的辅因子,它对植物的生长和发育有重要影响。目前,环境污染越来越严重,土壤中铜含量急剧增加。植物细胞内积累过量的Cu²⁺会对植物生长和代谢产生多种不利影响,导致细胞受到损伤。迄今为止,对晚期胚胎发生富集（late embroygenesis abundant,LEA）蛋白的研究已经进行了30多年,LEA蛋白不仅在植物种子成熟过程中表达,也可受干旱、低温、高盐、脱落酸（ABA）等胁迫的诱导而在植物营养组织中表达,提高植物对非生物胁迫的耐受性。LEA蛋白属固有无序蛋白（intrinsically disordered proteins,IDPs）,它在天然状态下不具备确定的三维结构,它的结构松散,肽链呈伸展状态,结构灵活易变。高柔性结构的LEA蛋白可以识别不同的配体,行使多重保护作用。LEA蛋白一般分为7组。本文以两个4组大豆LEA蛋白（Gm PM1和Gm PM9）为对象,研究了它们在提高植物耐Cu²⁺胁迫方面的保护作用及其分子机理。将大豆幼苗进行Cu SO4胁迫处理,不同时间点提取大豆幼苗叶和根中的RNA,反转录成c DNA。利用realtime PCR技术检测不同时间点的幼苗叶和根中Gm PM1和Gm PM9基因的相对表达量。结果显示,150mM Cu SO4胁迫3h和24h时Gm PM1和Gm PM9基因在大豆幼苗（叶和根）内的表达显著上调。将含Gm PM1和Gm PM9基因的酵母表达载体p YES2/Gm PM1、p YES2/Gm PM9和空载体p YES2/CT转化铜敏感型酵母突变体（Δcup2）,得到转基因重组酵母菌ΔCUP2/Gm PM1、ΔCUP2/Gm PM9和对照菌ΔCUP2/p YES2。测定100mM Cu Cl2下重组酵母菌的生长曲线。结果表明在Cu²⁺胁迫培养基中重组酵母细胞ΔCUP2/Gm PM1、ΔCUP2/Gm PM9在24h³6h期间生长速率快于对照ΔCUP2/p YES2。意味着Gm PM1或Gm PM9蛋白的表达可以提高重组酵母细胞抵抗Cu²⁺胁迫的能力,对铜敏感型酵母突变体（Δcup2）的功能缺失起到补偿作用。根据Gm PM1蛋白序列中组氨酸分布特点,设计并构建Gm PM1蛋白的不同缺失克隆,通过大肠杆菌体系表达纯化和化学合成两种方法获得Gm PM1蛋白及其8个相关短肽。利用Cu-抗坏血酸体系检测Gm PM1蛋白及其短肽清除羟基自由基的能力。结果显示Gm PM1和Gm PM9蛋白的清除羟基自由基效果最好,其半数抑制剂量（IC50）分别为0.66mM和0.81mM;短肽Gm PM1-C、Gm PM1-C1、Gm PM1-C2、Gm PM1-C3的羟基自由基清除能力较好,它们的抗氧化强弱为Gm PM1-C3（1.10mM）>Gm PM1-C（1.37mM）>Gm PM1-C1（2.20mM）>Gm PM1-C2（5.29mM）。短肽Gm PM1-N、Gm PM1-N1、Gm PM1-N2的羟基自由基清除能力较差。Gm PM1蛋白及其短肽的清除羟基自由基的能力与其所含组氨酸个数和蛋白总长度有关。通过等温热量滴定实验（isothermal titration calorimetry,ITC）对Gm PM1蛋白及其系列短肽与Cu²⁺结合力进行了定量研究。结果显示Gm PM1、Gm PM9、Gm PM1-C、Gm PM1-C1、Gm PM1-C2、Gm PM1-C3均具有较强Cu²⁺结合能力,其结合能力强弱为:Gm PM1-C2>Gm PM9>Gm PM1>Gm PM1-C1>Gm PM1-C>Gm PM1-C3。而N端因不含组氨酸,不能与Cu²⁺结合。通过圆二色谱（circular dichroism spectrum,CD）分析Gm PM1蛋白及其系列短肽与Cu²⁺结合前后的二级结构变化。结果显示,Cu²⁺加入后Gm PM1、Gm PM9、Gm PM1-N、Gm PM1-N1、Gm PM1-N2、Gm PM1-C1、Gm PM1-C3的无序结构稍有减少。特别是Cu²⁺可诱导Gm PM1-C和Gm PM1-C2的有序结构含量升高,PII结构含量减少。由上述研究结果可知,Gm PM1和Gm PM9蛋白的表达上调有利于提高植物对Cu²⁺胁迫的耐受性。Gm PM1蛋白C-端含组氨酸较高,通过C-端的组氨酸可直接结合Cu²⁺,发挥清除羟基自由基的能力,这在提高植物细胞抗氧化保护等过程中发挥作用。可以认为,Gm PM1和Gm PM9蛋白很有可能通过其C端发挥以上保护作用,这是Gm PM1和Gm PM9保护植物免受Cu²⁺胁迫的重要分子机理。