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研究目的本实验利用BALB/c小鼠的调节性T细胞（Treg）,研究在不同剂量、不同时间IL-15作用下,细胞发生自噬的情况以及免疫功能的变化。明确IL-15对Treg自噬作用和免疫功能影响。进一步利用IL-15、自噬抑制剂SBI-0206965或自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin,Rap）处理细胞,探索IL-15通过调节Treg细胞自噬影响其功能的相关分子机制。研究方法1、取BALB/c小鼠脾脏,通过MiniMACs免疫磁性分离系统从单个核细胞中分离CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25-T细胞（效应性T细胞,Teff）。利用流式细胞技术对细胞进行纯度鉴定和活力检测。2、IL-15对Treg细胞相关分子Foxp3和CTLA-4表达的影响:将分离出的Treg细胞计数,以2×105个/孔接种于96孔板。按照IL-15浓度分为10ng/ml组、25ng/ml组、50ng/ml组和100ng/ml组;按照培养时间分组,分为12h组、24h组、48h组和72h组。分别给予相应剂量和IL-15处理相应时间,置于37℃、5%CO2培养箱静置培养。分别收集细胞后,采用流式细胞术检测Foxp3和CTLA-4表达水平。3、IL-15对Treg细胞自噬的相关分子LC3的影响:选取IL-15对Treg细胞活化影响的最佳剂量和时间条件。将分离出的Treg细胞计数,以2×105个/孔接种于96孔板。对细胞进行分组:Control组、IL-15组、SBI组、IL-15+SBI组、Rap组、IL-15+Rap组。此外,为模拟脓毒症体外环境加入LPS,进行同样的分组。分别给予相应的试剂处理后,对细胞进行免疫荧光染色,共聚焦观察LC3的表达,研究Treg细胞内自噬体的形成情况。并收集细胞,利用流式细胞术检测LC3分子表达水平。4、IL-15和细胞自噬对Treg细胞相关分子Foxp3和CTLA-4表达的影响:将分离出的Treg细胞计数,以2×105个/孔接种于96孔板。对细胞进行分组:Control组、IL-15组、SBI组、IL-15+SBI组、Rap组、IL-15+Rap组。此外,为模拟脓毒症体外环境加入LPS,进行同样的分组。收集细胞后,Foxp3和CTLA-4分子进行流式细胞术检测其表达水平。5、IL-15对Treg细胞免疫功能的影响:采用ELISA法检测各个分组上清液中IL-10和TGF-β水平的变化。并将Treg和Teff进行共培养后,检测上清液中IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌水平。研究结果1、按上述步骤从BALB/c小鼠单个核细胞中分选出CD4+CD25+Treg细胞后检测其纯度达到92%以上,Teff细胞的纯度为95%,苔盼蓝检测到CD4+CD25+Treg的活性均在94%以上。2、IL-15在剂量为100ng/ml处理48h的条件下,Treg细胞表面分子Foxp3和CTLA-4的表达水平显著增加（P<0.01）,在此情况下,IL-15对Treg细胞刺激最为明显。因此选定该条件处理后续实验。3、共聚焦显微镜观察免疫荧光和流式细胞术分析结果均显示,相较于Control组,IL-15组和SBI组LC3分子表达水平显著减少,IL-15+SBI组明显增加（P<0.05）,Rap组和IL-15+Rap组显著上调（P<0.01）。在LPS刺激Treg细胞条件下,较Control组,IL-15组和SBI组的LC3分子表达水平显著下调,IL-15+SBI组明显增加（P<0.05）,Rap组和IL-15+Rap组显著增强（P<0.01）。4、流式细胞分析结果显示:相较于Control组,IL-15组和IL-15+Rap组细胞Foxp3表达显著上调（P<0.01）,IL-15+SBI组和Rap组细胞Foxp3和CTLA-4表达均有增加（P<0.05）。在LPS刺激Treg细胞条件下,IL-15+Rap组细胞Foxp3和CTLA-4表达水平在比Control组显著增多（P<0.01）。5、采用ELISA技术检测各个组细胞培养上清液中细胞因子分泌水平,结果证实加入IL-15处理后,IL-10和TGF-β水平均有明显上升（P<0.01）。在与Teff共培养后,IL-15组细胞分泌IFN-γ/IL-4比值较Control组有所下降,Teff具有向Th2极化的趋势。结论:100ng/ml IL-15在处理Treg细胞48h后,可明显诱导细胞表达相关分子Foxp3和CLTA-4,并诱导细胞自噬的发生。IL-15通过CD4+CD25+Treg自噬介导其活化并发挥免疫抑制功能。