皮肤癣菌是一类寄生于人类以及动物皮肤浅层角蛋白组织的丝状真菌。目前己报告的皮肤癣菌大约有45种,其中部分仅能感染动物,尚未证明可以侵犯人体。对人类有致病作用的大概有20余种。按照菌落特征及大分子孢子的形态,皮肤癣菌可分为3属：毛癣菌属,表皮癣菌属及小孢子菌属。皮肤癣菌引起的体癣、股癣、甲癣等浅部感染在全世界范围内流行,具有极高的发病率和患病率。红色毛癣菌是最主要的致病皮肤癣菌,有报道称临床上一半以上体癣、90%以上的股癣和手足癣由红色毛癣菌引起。近年有研究表明糖皮质激素、免疫抑制剂的广泛应用等以及外伤、局部放疗、长期外用糖皮质激素类药物是引发红色毛癣菌深部感染的易感因素,红色毛癣菌可以引起脓癣、脓肿和肉芽肿等皮肤及皮下组织感染。现在国内外对红色毛癣菌肉芽肿株的研究大多为单个病例报道,主要集中在红色毛癣菌深部感染的分类、特殊临床表现、疾病诱发因素以及病原学来源等,尚缺乏对红色毛癣菌肉芽肿菌株的相关研究。实验第一部分拟对分离自我科的三例癣菌性肉芽肿患者的红色毛癣菌菌株进行生物学性状及基因分型研究,并与分离自浅表感染的菌株进行比较,了解红色毛癣菌肉芽肿菌株的微生物学特征,为进一步研究其致病机制打下基础。红色毛癣菌引发的深部感染不仅需要系统性抗真菌治疗,而且治疗时间长且易复发,严重影响患者的生活质量。为了更好地治疗皮肤癣菌病,皮肤癣菌病的动物模型在评估抗菌药物的疗效中发挥了重要作用。现在关于皮肤癣菌动物模型大多用须癣毛癣菌,而红色毛癣菌为亲人性皮肤癣菌,动物模型的构建相对困难,并且有关红色毛癣菌和宿主间的相互影响机制现在也尚不清楚。近年来国内学者在糖皮质激素干预下,在豚鼠背部建立了红色毛癣菌浅表感染模型,但是关于红色毛癣菌导致深部感染的动物模型目前尚没有相关研究。实验第二部分拟利用分离来自红色毛癣菌肉芽肿患者的菌株,采用注射足垫的方法,构建红色毛癣菌肉芽肿动物模型,为进一步探讨红色毛癣菌引起深部感染的发病机制、感染后免疫和病理过程及红色毛癣菌治疗药物疗效的评价提供实验基础。1红色毛癣菌肉芽肿株和浅表感染株的生物学性状和基因型的比较研究1.1目的研究红色毛癣菌肉芽肿株和浅表感染临床株生物学性状和基因型。1.2对象和方法对象：收集南京总医院皮肤科门诊2013年4月-2015年5月就诊的3例红色毛癣菌肉芽肿患者和2015年4月就诊的11例浅表感染患者的临床分离菌株。红色毛癣菌标准株ATCCMYA4438和须癣毛癣菌CMCC(F)T5a(由卫生部医学微生物菌(毒)种保藏管理中心真菌中心中国医学科学院皮肤病研究所赠送)。方法：(1)将临床分离菌株进行纯化,传代,然后接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基,置于27℃培养箱下,培养10天。观察菌落外观、质地及背面颜色。采用传统形态学方法和分子生物学对分离菌株进行鉴定。(2)将全部分离株接种马铃薯葡萄糖琼脂培养基上,28℃孵育7 d挑取红色毛癣菌菌落置入研磨器中,加入生理盐水,研磨后制成均匀菌悬液,用血细胞计数板调整孢子浓度为1×107CFU/mL。(3)将肉芽肿株和标准株菌ATCCMYA4438悬液以移液枪取10μL菌悬液接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板中,每株接种18个,分别置于25℃27℃、 35℃、37℃、39℃、41℃各3个。浅表感染分离株菌悬液30株以移液枪取10μL菌悬液接种于PDA平板中,每株接种6个,分别置于27℃、37℃下各3个逐日观察比较菌落形态大小变化,观察3周,拍照并测量记录下14天和21天时菌落最外直径。实验重复操作3次,取平均值。(4)按照美国国家临床和实验室标准的M38-A2方案采用微量液体稀释法在体外进行药敏试验。在含抗真菌药物的96孔板的1-11列孔加入2倍终浓度的菌悬液,270C温箱孵育,7天后观察结果。4种抗真菌药物为伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬和酮康唑。检测分离株最低抑菌浓度(MIC),以ATCCMYA4438为质控株。实验重复操作至少3次,取平均值。(5)用Bi-opsin真菌基因组DNA提取试剂盒按照说明提取菌株DNA,对菌株TRS-1 (NTS区内串联重复亚单位1)、TRS-2区(NTS区内串联重复亚单位2)进行PCR扩增鉴定菌株基因型。PCR反应产物的检测：用1.5%琼脂糖凝胶电泳后,在凝胶程序系统中观察结果,并采集保存图像,剩余肉芽肿株PCR产物送Invitrogen贸易有限公司测序,测序结果与genebank基因序列比对分析。(6)采用SPSS20软件,运用随机区组设计资料的方差分析和配对样本t检验分本析对菌落直径数值进行统计学分析。1.3结果(1)菌株鉴定结果3株肉芽肿患者临床分离株经传统培养及分子生物学鉴定为红色毛癣菌。11株浅表感染患者临床分离株经传统培养均鉴定为红色毛癣菌。(2)红色毛癣菌温度试验结果经过随机区组设计资料的方差分析,红色毛癣菌肉芽肿株3株和标准株ATCC4438菌株和温度都有差异(P<0.05、P<0.05)。14天、21天标准株ATCC4438在25℃、27℃培养条件下菌落直径大于其在35℃、37℃培养条件下的菌落直径,三株肉芽肿菌株在35℃、37℃、27℃三个温度条件下菌落直径均无差异(P>0.05),39℃、41℃下肉芽肿株不生长。11株浅部感染分离株在27℃培养条件下菌落直径均大于其在37℃培养条件下的菌落直径(P<0.05)。(3)体外药物敏感试验结果肉芽肿株和浅部感染株对伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬和酮康唑的MIC值均在正常范围内,无耐药株出现。(4)基因型分析结果TRS-1区根据条带不同分为4型,NJT001、浅2、浅4、浅7、浅10为type1型；NJT002、ATCC4438.浅3、浅5、浅6、浅9、浅11为type2型：浅1为type3型；NJT003、浅8为type4型。TRS-2区根据条带不同可分为2型,肉芽肿株和标准株均在500bp处形成条带,仅有浅5在400bp左右条带。NJT001TRS-1区序列长441bp,与GenBank中红色毛癣菌(AF222889)有1个碱基差异；TRS-2区序列长508bp与GenBank中红色毛癣菌(AF222890、AF222887)均有3个碱基差异。NJT002 TRS-1区序列长605bp,与GenBank中红色毛癣菌(AF222887)有16个碱基差异,TRS-2区序列长509bp与GenBank中红色毛癣菌(AF222890、AF222887)均有3个碱基差异。NJT003 TRS-1区序列长898bp,与GenBank中红色毛癣菌(JX431933)有19个碱基差异,TRS-2区序列长508bp与GenBank中红色毛癣菌(AF222890、AF222887)均有2个碱基差异。1.4结论红色毛癣菌肉芽肿株的鉴定需要病理学和分子生物学等才能明确鉴定。本文中红色毛癣菌肉芽肿株较浅表感染分离株更耐热,肉芽肿株和浅表分离株对伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬和酮康唑的敏感性无差异,均未发生耐药。肉芽肿株和浅表分离株基因分型无差异。3株肉芽肿菌株TRS-1区序列与GenBank中的红色毛癣菌分别有1、3和19个碱基差异,TRS-2区序列与GenBank中的红色毛癣菌分别有2-3个碱基差异,从而推测三例肉芽肿菌株可能是红色毛癣菌的一个变种。2红色毛癣菌感染BalB/C鼠肉芽肿模型的构建2.1目的红色毛癣菌不仅引起皮肤浅部感染还可引起深部感染,但相关动物模型未见研究报道。本部分拟构建红色毛癣菌感染的癣菌性肉芽肿模型。2.2对象和方法对象：红色毛癣菌肉芽肿分离株3株,来自2013年4月到2015年5月南京总医院皮肤科门诊的3位红色毛癣菌肉芽肿患者组织,分离自体癣患者的体癣株2株,菌株均经传统方法的分离培养并经分子生物学鉴定,依次命名为NJT001-NJT003.浅1和浅2。红色毛癣菌标准菌株ATCCMYA4438(由卫生部医学微生物菌(毒)种保藏管理中心真菌中心中国医学科学院皮肤病研究所赠送,分离自美国患者趾甲)。方法(1)普通级健康BalB/C小鼠52只,随机分为13笼,4只小鼠置于1笼,编号为1-13。将13笼小鼠分为3组,第1组为空白对照组(为第1笼,不接种红色毛癣菌)；第2组为PBS菌悬液组,第2-7笼,依次接种NJT001、NJT002、 NJT003、浅1、浅2和ATCCMYA4438红色毛癣菌PBS菌悬液。第3组为实验组,第8-13笼,依次接种NJT001、NJT002、NJT003、浅1、浅2和ATCCMYA4438红色毛癣菌黏液素菌悬液。(2)除空白对照组外,接种前7d开始,每日1次给予地塞米松磷酸钠注射液25mg.kg-1·d-1腹腔注射BalB/C鼠。将实验菌株制成无菌的PBS和无菌的黏液素溶液(5g/100m1)菌丝段(含分生孢子)悬液,在细胞计数板下调整菌丝段／孢子浓度为1×108/ml待用。(3)接种时对小鼠足垫进行常规消毒,用1ml注射器吸取上述菌悬液,向小鼠一只足垫中注射0.2m1菌悬液,另一只作为阴性对照。空白对照组注射0.2m1生理盐水。(4)各组动物给予地塞米松磷酸钠注射液25 mg.kg-1·d-1腹腔注射,每天注射1次,共21次。每天观察实验动物接种处皮肤肿胀破溃变化。接种后第21天处死动物,取接种处皮肤脓液涂片进行直接镜检,同时将病变组织接种于含氯霉素和放线菌酮的PDA培养基,置于培养箱27℃下培养。动物处死后,剪取接种处全层皮肤组织,中性甲醛固定,石蜡包埋切片,分别行HE染色和PAS染色。2.3结果(1)大体变化 空白组、PBS菌悬液组和实验组浅1、浅2和ATCCMYA4438处理后足垫注射菌悬液后出现肿胀,一周后肿胀逐渐消退,两周后肿胀完全消退,与阴性对照无异。实验组NJT001、NJT002、NJT003处理后小鼠足垫注射菌悬液后出现肿胀,肿胀持续不消退,接种后第15天开始,小鼠足垫出现破溃和脓肿。直至动物处死,脓肿和破溃持续存在,无愈合倾向。(2)直接镜检结果 直接镜检可见实验组NJT001、NJT002、NJT003处理后小鼠足垫脓液中存在细长菌丝,而空白组、PBS菌悬液组和实验组浅1、浅2和ATCCMYA4438处理后小鼠足垫接种处均没有脓液,故取组织加等渗盐水研磨后进行直接镜检,均未见菌丝和孢子。(3)组织培养结果实验组NJT001、NJT002、NJT003处理后小鼠组织接种平板培养7天后,可见菌落生长,且与接种前菌落形态基本相同。小培养及分子生物学鉴定证实与接种菌株相同。而空白组、PBS菌悬液组和实验组浅1、浅2和ATCCMYA4438处理后小鼠组织培养21d后均未见真菌生长。(4)组织病理结果HE染色下空白组、PBS菌悬液组、实验组浅1、浅2和ATCCMYA4438处理后小鼠足部组织未见肉芽肿组织形成,实验组NJT001、 NJT002和NJT003处理后小鼠足部组织可见表皮角化过度,真皮内肉芽肿形成,内含中性粒细胞、淋巴细胞等大量炎细胞浸润,同时还可见大片坏死区域。PAS染色下空白组、PBS菌悬液组和实验组浅1、浅2和ATCCMYA4438处理后小鼠足部组织真表皮内未见到菌丝和孢子,在实验组NJT001、NJT002和NJT003处理后小鼠组织中可见到真皮内大量细长分隔菌丝。2.4结论利用临床分离的红色毛癣菌肉芽肿菌株,经黏液素和糖皮质激素干预后可以构建小鼠红色毛癣菌肉芽肿模型。