论文部分内容阅读
目的反硝化型甲烷厌氧氧化反应(Denitrifying anaerobic methane oxidation,DAMO)是一种最新发现的生物反应,是连接碳氮循环的重要环节。本研究采用分子生物学技术研究了西湖、钱塘江和椒江入海口底泥中DAMO微生物的分布与种群多样性状况,为中药材生产的生态环境质量的评估提供微生物学方面的理论依据。方法(1)采样:采用抓斗式采泥器采集西湖、钱塘江和椒江入海口表层底泥。样品采集之后立即放入4℃冰箱冷藏,以供实验室后续研究使用。(2)DNA 抽取与 PCR 扩增:用 Power Soil DNAKit(Mo Bio Laboratories,Carlsbad,CA)对底泥样品进行总细菌基因组DNA抽提,抽提结果用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。采用巢式PCR对底泥样品DNA进行DAMO菌的16S rRNA和pmoA基因进行PCR扩增。(3)克隆与测序:将含有目标条带的PCR产物连接到PMD19-T(TAKARA)载体上,按试剂盒操作说明进行分子克隆实验。用菌液PCR(1μL的菌液作为模板)验证阳性克隆。委托深圳华大基因公司对阳性克隆进行测序。(4)16SrRNA和pmoA基因系统发育分析:获得的序列用MEGA4.0软件进行编辑,用BLAST在GenBank中搜索相似序列,对这些序列进行多重序列对齐,最后采用MEGA4.0的邻接(Neighbor-Joining)法构建系统发育树。(5)定量PCR:用DAMO菌16SrRNA的特异性引物对采集的底泥样品中的DAMO菌的16SrRNA基因拷贝数进行数量分析。(6)统计学分析:用DOTUR软件对所获得的DAMO菌的16SrRNA和pmoA基因进行OTU(Operational taxonomic units,操作分类单元)分类并分析其香农指数和chao1指数;用CANOCO软件的PCA分析所获得的DAMO菌的菌群分布,CCA和RDA分析所获得的DAMO菌的菌群分布与环境因子之间的关系;用SPSS软件的Pearson分析所获得的DAMO菌的数量、生物多样性与环境因子之间的关系。结果通过巢式PCR成功在不同生境底泥样品中扩增出了 DAMO菌16S rRNA和pmoA基因的特异性条带。为进一步了解各底泥中DAMO菌的菌群结构与多样性水平,将PCR产物进行克隆测序,并将获得的有效序列处理后与目前已发现的DAMO菌的16SrRNA和pmoA序列共同构建系统发育树。系统发育分析表明,西湖底泥中获得的DAMO菌的16S rRNA序列与M.oxyfera的16S rRNA序列相似度为93%到97%,获得的pmoA序列与M.oxera的pmoA序列相似度为86%到95%;钱塘江底泥中获得的DAMO菌的16S rRNA序列与M.oxera的16S rRNA序列相似度为90%到99%,获得的pmoA序列与M.oxyera的pmoA序列相似度为86%到95%;椒江入海口底泥中获得的DAMO菌的16S rRNA序列与M.oxyfera的16S rRNA序列相似度为92%到97%,获得的pmoA序列与M.oxera的pmoA序列相似度为85%到95%。DOTUR分析表明西湖底泥、钱塘江底泥和椒江入海口底泥中DAMO菌的16SrRNA基因的OTU数分别为2、15、3,pmoA基因的OTU数分别为5、13、16。定量PCR结果表明,西湖底泥、钱塘江底泥和椒江入海口底泥中DAMO菌的16SrRNA基因的拷贝数分别为2.15×105拷贝/g(干重),1.32×106到 1.03×107 拷贝/g(干重),5.80×04到 8.35 ×107拷贝/g(干重)。RDA 分析表明,氨、总无机氮和有机质的含量对钱塘江底泥中DAMO菌的分布有较为显著的影响(p<0.05),有机质含量对椒江入海口底泥中DAMO菌的分布起着最重要的影响。结论本研究通过DAMO菌的16S rRNA和pmoA基因的文库构建和16S rRNA基因的定量PCR,证明了西湖底泥、钱塘江底泥和椒江入海口底泥中分布有DAMO菌,为流域生态系统碳氮循环增添了新的内容。通过系统发育分析表明,钱塘江底泥和椒江入海口底泥中检测到的DAMO菌的16SrRNA和pmoA基因的多样性较高,要明显高于目前已报道的文献,为DAMO菌的生物多样性增添了新的内容。通过统计学分析表明,氨、总无机氮和有机质的含量对钱塘江和椒江入海口底泥中DAMO菌的分布有显著影响,有机质含量对椒江入海口底泥中DAMO菌的分布起着最重要的影响。本研究为中药材生产的生态环境质量的评估提供微生物学方面的理论依据。