背景介绍胰岛主要由分泌胰高血糖素的α细胞,分泌胰岛素的β细胞,分泌生长抑素的δ细胞,分泌饥饿激素的ε细胞以及分泌胰多肽的PP细胞构成。其中胰岛β细胞作为体内分泌胰岛素的唯一细胞类型,在血糖调节中起着至关重要的作用,β细胞的功能异常通常会导致糖尿病等代谢性疾病,因此β细胞一直是研究的热点。随着研究的不断深入,人们发现,在胰岛中不同的细胞类型之间存在相互的调节作用。胰岛δ细胞通过旁分泌生长抑素的方式对胰岛α细胞和β 细胞的活性进行调控。由药物或遗传因素导致的δ细胞中生长抑素的异常分泌,可导致β细胞的内分泌功能失调,并进而引发糖代谢紊乱和相关代谢性疾病。尽管胰岛δ细胞的研究已经取得了一定的进展,但对于其功能尤其是在血糖稳态调控中的作用,目前仍存在较大争议。已有研究表明,尽管生长抑素基因敲除小鼠的进食后胰岛素和胰高血糖素分泌水平均有显著增高,但这些小鼠依然具有和正常小鼠相似的体重、胰岛形态、胰岛素和胰高血糖素含量、静息血糖水平和胰岛素敏感度。因此,这些研究结果提示胰岛δ细胞可能并不参与静息状态下血糖调控。为了对这一问题进行深入研究并进一步解析δ细胞在胰岛环路以及血糖稳态中的作用,本实验利用Cre-LoxP重组酶系统,构建了可在分泌生长抑素的细胞中特异性表达白喉毒素A片段的小鼠。由于白喉毒素A片段能够抑制蛋白质的合成进而杀死细胞,因此小鼠体内δ细胞可被特异性敲除。我们对该δ细胞特异性敲除小鼠的生理表型进行了研究,并采用连续切片技术和免疫荧光的方法,通过胰腺组织的免疫荧光共染,实时定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, Q-PCR)和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)等实验方法进一步研究了 δ细胞在血糖稳态调节中的作用。材料与方法本实验选用的实验鼠为C57BL/6J小鼠,分别为胚胎期12.5天(E12.5)、15.5天(E15.5)和18.5天(E18.5)的胚胎鼠,新生1天的小鼠(P1),以及出生后1周(1 week)和8周(8 week)小鼠,以及SSTCre(+/+)和R26DTA(+/-)两种工具鼠,两者杂交获得SSTCre(+/-)和SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)两种实验鼠。另外还选用wistar大鼠乳鼠。取各时间点小鼠的胰腺,运用连续切片技术和免疫荧光的方法,通过胰腺组织的免疫荧光共染,包括生长抑素和胰岛素的共染以及生长抑素与胰高血糖素的共染,直观显示胰岛δ细胞在小鼠不同发育阶段的形成及分布情况。通过免疫荧光和激光共聚焦显微技术以及Q-PCR的方法验证SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)鼠胰岛δ细胞的特异性敲除情况。通过生长抑素和胰岛素的共染以及生长抑素与胰高血糖素的共染,直观显示δ, α和β细胞在SSTCre(+/-)和SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)这两种小鼠以及各时间点小鼠中的数目和分布情况。通过Q-PCR的方法检测小鼠中胰高血糖素,胰岛素,胰多肽和饥饿激素的mRNA水平。采用ELISA实验分别检测小鼠血浆和胰腺中胰岛素和胰高血糖素的含量。实验结果通过系统研究胰岛δ细胞的发育我们发现,E15.5时δ细胞开始分化出现;E18.5天和P1的小鼠胰岛初步形成,但尚不规则;1周小鼠胰岛基本规则成型;4周和8周小鼠胰岛形状稳定规则;δ细胞分布于胰岛的外周。我们通过免疫荧光实验和Q-PCR确证了 SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠胰岛内的δ细胞敲除情况。δ细胞特异性敲除小鼠表现出严重的低血糖症状,其体重与血糖水平均明显低于SSTCre(+-)对照组小鼠,并于出生后24小时内死亡,通过给其皮下注射葡萄糖可以在一定范围内延长SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠的平均寿命。ELISA的实验结果显示,SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠血浆中的胰岛素水平明显高于SSTCre(+/-)小鼠,并且SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠胰腺内的胰岛素和胰高血糖素含量均高于SSTCre(+/-)小鼠。免疫荧光实验结果表明,虽然SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠的胰岛细胞总数目相较于SSTCre(+/-)小鼠并无明显差别,但是δ细胞的特异性敲除导致小鼠胰岛内α细胞和β细胞的比例明显上升。结论本实验的结果直观的显示了小鼠胰岛δ细胞的产生和分布情况,胰岛δ细胞的发生及其与胰岛内其他内分泌细胞之间的相互作用与胰岛发育过程密切相关。胰岛δ细胞可能通过旁分泌的方式对胰岛的形态发生和发育起到重要的调控作用。我们的研究发现,胰岛δ细胞的特异性敲除,导致小鼠胰岛内分泌细胞的比例变化,并进而导致胰岛素和胰高血糖素的分泌增多,引发新生鼠血糖过低致死。我们的研究结果,从细胞整体水平揭示了 δ细胞对胰岛内分泌细胞的发生发展过程,以及对血糖稳态,尤其是对静息状态下的血糖稳态,均起到关键的调控作用。