目的心脏机械瓣膜置换术后(MHVR)需常规抗凝治疗。华法林作为经典口服抗凝药物为MHVR患者长期抗凝首选,但其起效慢,术后早期需肝素类桥接抗凝,而对于肝素类药物的选择、剂量推荐在我国患者中缺乏相关指南和研究;华法林个体差异大,基因和临床因素均可影响华法林维持剂量(Maintenance dose,MD),已有多种模型用于预测MD,但对于MHVR术后早期,华法林敏感性增加,各种已知的影响MD的因素、相关基因和具体临床因素(围术期生理病理变化、围术期用药等)对华法林起始响应的影响仍需进一步明确;INR在治疗范围内的时间(time in therapeutic range,TTR)反映抗凝稳定性,与不良事件相关,而我省患者的TTR影响因素尚未见报道;头孢哌酮舒巴坦可显著影响华法林早期响应,但其机制不完全明确。为此本论文将以甘肃地区患者为研究对象,评价MHVR早期不同桥接抗凝方案;筛选与华法林抗凝初期和维持期响应最相关的因素,并建立预测初始达标剂量和MD的计算方程,明确各因素在初始达标剂量模型和MD模型中解释剂量变异的比例;评价相关基因和临床因素对TTR的影响;此外,基于相关转运体初步探讨头孢哌酮舒巴坦影响华法林体内过程和增加华法林药效的机制。方法1.心脏瓣膜置换术后早期不同桥接抗凝方案的比较研究纳入305名MHVR患者进行前瞻性、单中心、观察性队列研究。根据术后不同桥接抗凝方案,患者被分为3组:普通肝素(UFH)组109例,低分子肝素(LMWH)组97例,UFH联合LMWH(UFH-LMWH)组99例。所有患者均随访4周,主要临床结局为出血和栓塞事件。2.基因与临床因素对华法林响应的影响与剂量预测在这项观察性研究中,纳入了289例MHVR早期华法林治疗的患者。收集患者基因型VKORC1-1639 G>A(rs9923231),CYP2C9*2(rs1799853),CYP2C9*5C1080G(rs28371686),CYP2C9*3(rs1057910),CYP2C19*2(rs 4244285),CYP4F2V433M(rs2108622),GGCX(rs11676382),ABCB1 C3425T(rs 1045642)和ABCG2C421A(rs2231142)信息、临床特征、对治疗的反应、出血和血栓事件情况。随访至少30天,主要临床结局是INR首次大于等于治疗范围下限(≧LLTR)所需时间和华法林剂量。采用逐步多元线性回归的方法,建立了预测达标所需华法林剂量的算法,并进行内部和外部验证。采用cox回归分析影响达标时间因素的风险比,logistic回归分析首次INR≧3.5的危险因素。随访3个月记录患者每次监测的INR值、华法林剂量,采用logistic回归分析TTR<70%的危险因素及其OR值。随访1年得到患者的维持剂量(MD),单因素和多因素分析对MD有显著影响的基因和临床因素,建立方程并与达标剂量方程比较。3.头孢哌酮舒巴坦对华法林药动学和药效学的影响与其机制初探在长期药效学实验中,将Wistar大鼠连续给予治疗剂量华法林(0.125 mg/kg qd)15天,使INR稳定于治疗范围(1.6-2.0)。随后将大鼠分为单用组和合用组,再给药4天,单用组继续只给予华法林(0.125 mg/kg qd),合用组给予华法林(0.125 mg/kg qd)并腹腔注射头孢哌酮舒巴坦(0.3 g/kg bid),比较单用与合用组INR值在4天内的变化。在药动学和组织分布实验中,将大鼠分为两组,单用组腹腔注射生理盐水(0.1ml/100g bid),合用组腹腔注射头孢哌酮舒巴坦(0.3 g/kg bid),连续预处理4天。预处理期间测定血中维生素K1、K2含量在合用组的变化。随后,在第5天,将单用组和合用组再分别分为低剂量华法林组和高剂量华法林组。低剂量单用组灌胃给予华法林(0.125 mg/kg),高剂量单用组给予华法林(0.5 mg/kg),低剂量和高剂量合用组分别给予0.125 mg/kg和0.5 mg/kg华法林后立即腹腔注射头孢哌酮舒巴坦0.3 g/kg。不同时间点股动脉采血,测定华法林血药浓度,同时尾静脉采血测定INR值。采用LC/MS/MS分别测定华法林、S/R-华法林的含量,采用非房室模型计算药动学参数。此外,将另一批大鼠分为两组,即低剂量单用组和合用组,其预处理和给药方式同上,在第5天给药后,分别采集低剂量单用组和合用组大鼠在10 min、2 h、6 h和10 h肝脏组织,此外,在2 h时间点同时采集回肠、肾脏、脾脏、肺和胰腺组织,测定各组织中S/R-华法林的含量。采用Western blotting法测定肝脏和回肠组织中P-gp的表达,RT-qPCR测定肝脏中Oat2mRNA的表达量。为了探讨头孢哌酮舒巴坦对华法林肝摄取影响的机制,在HepaRG细胞培养基中加入1μM华法林与同时加入1μM华法林和350μM头孢哌酮舒巴坦进行培养,考察头孢哌酮舒巴坦对华法林对映体在不同时间点的细胞摄取量。结果UFH组中有2名患者术后出现了栓塞卒中事件。与UFH组相比,LMWH组出血事件发生率增加(10.3%vs 2.8%,P=0.03)。在第二终点方面,相比于UFH组,LMWH呈现出使ICU住院时间(P=0.08)、术后住院时间(P=0.08)、INR达标时间(P=0.06)缩短的趋势。肌酐水平[OR 1.03,95%CI(1.01-1.05),P=0.02]与高血压[OR 3.72,95%CI(1.35-10.28),P=0.01]为出血事件的危险因素。单变量分析的结果显示,VKORC1-1639 G>A、CYP2C9*1/*3、头孢唑啉、头孢哌酮舒巴坦、体重指数增加、Δ血红蛋白(ΔHb,术前与术后血红蛋白之差)和白细胞计数可以独立影响患者华法林抗凝治疗的初期反应。多元线性回归得出如下方程:华法林达标累积剂量(mg)=14.376 VKORC1-1639G>A–2.865高血压+0.468 BMI–0.108年龄+2.366 ABCB1 CT/TT–4.050 CYP2C9*1/*3–4.843头孢哌酮舒巴坦–0.062ΔHb–2.530头孢唑林+0.323术前血浆白蛋白–16.200,此方程可解释INR首次达到大于等于治疗范围下限(≧LLTR)所需的华法林剂量43.9%的个体差异。外部验证结果显示,华法林累积剂量预测剂量和实际剂量之间有很强的相关性(Pearson r=0.6404,P<0.0001)。VKORC1-1639 GA/GG、头孢哌酮舒巴坦和胺碘酮显著影响首次达标INR值。合用头孢哌酮舒巴坦患者首次INR≥3.5的风险高于未使用的患者[OR 1.565,95%CI(1.156-2.119),P=0.004];年龄是INR≥3.5的另一个独立影响因素[OR 1.082,95%CI(1.035-1.130),P<0.001];随访期间,携带VKORC1 AA的患者首次INR≥3.5的风险高于携带VKORC1 GA/GG的患者[OR 5.487,95%CI(1.223-24.621),P=0.026]。单变量分析显示年龄、BMI、胺碘酮、VKORC1-1639G>A和CYP2C9*1/*3与MD显著相关。MD(mg/day)=1.436VKORC1-1639 G>A-0.967CYP2C9*1/*3-0.043胺碘酮+0.033血浆白蛋白-0.010年龄+0.032 BMI+0.688,该算法可解释40.2%MD的变异。其中VKORC1-1639G>A占27.8%,比重最大。年龄和合用头孢唑林是TTR<70%的危险因素。长期药效学实验结果显示,给予大鼠治疗剂量华法林15天后,INR维持在治疗范围,在第16天,与单用组相比,合用组同时给予华法林和头孢哌酮舒巴坦后10小时其INR增幅就有统计学意义,并呈逐渐上升趋势。随着头孢哌酮舒巴坦预处理天数增加,维生素K1、K2含量逐渐下降,第4天时出现显著性下降。药动学实验结果显示,与低剂量华法林单用组相比,低剂量华法林合用组的华法林和S-华法林的AUC0-t、Cmax均显著增加,CL/F均显著下降;合用组INR值也在给药后8 h有显著性升高;合用组回肠和肝脏P-gp表达明显降低,肝脏Oat2的mRNA表达量显著降低;合用组S-华法林在给药后2 h、6 h、10 h的肝脏分布显著降低;合用组华法林S/R对映体在给药后2 h回肠、肾脏分布显著增加。此外,头孢哌酮舒巴坦可显著降低S/R华法林在HepaRG细胞中各时间点的摄取量。结论对于MHVR术后患者,UFH桥接出现了两例卒中事件,与UFH相比,LMWH有助于患者早期获得抗凝效果和缩短住院时间,但增加了出血事件的发生率。UFH-LMWH组无栓塞事件,出血发生率与UFH组无差异,在三种桥接方案中更易被接受。在华法林治疗初期,遗传因素(VKORC1、CYP2C9和ABCB1基因型)和临床因素(年龄、BMI、抗菌药物、高血压、ΔHb和白蛋白水平)均影响华法林的抗凝作用。由于抗凝初期和维持期影响因素不同,相同影响因素占比不同,不宜直接使用MD作为起始剂量。年龄和头孢唑林影响患者TTR,而基因多态性与TTR无相关性。头孢哌酮舒巴坦可快速、显著地影响华法林药效,这与头孢哌酮舒巴坦可减少维生素K的合成有关,还可能与其抑制肠道P-gp表达,增加华法林吸收速率和吸收程度;抑制肝脏Oat2的mRNA表达量,减少华法林特别是S-华法林在肝脏的摄取,从而增加华法林体内暴露量、延长其在体内的时间有关。