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叶绿体是绿色植物特有的细胞器,并且光合作用、光呼吸和氮代谢等多种重要代谢途径均在此发生,因此研究清楚叶绿体的生长发育对了解植物的发育和产量等具有重要意义。本研究通过EMS诱变拟南芥Col-0种子,从其M2代突变体库中筛选到一棵叶片延迟变绿突变体:该突变体的新生叶具有明显的黄化表型,黄化的幼叶随着叶片的发育由叶尖开始慢慢回绿,最终整个叶片变为绿色,因此在营养生长期该突变体表现为老叶呈绿色,新叶呈黄色,具有完整的生活史。以该突变株为材料研究叶绿体的发育,获得了如下研究结果:1.突变基因的定位将Col-0背景的突变体与Ler野生型杂交,构建图位克隆群体,以均匀分布在拟南芥5条染色体上的24对Marker引物进行初步定位。将突变基因初步定位在1号染色体3.83M~8.00M之间,通过设计新的引物将突变基因精细定位至1号染色体5.3M~5.83M之间。进行基因组重测序,发现在5.3M~5.83M区间发生较可信的SNP突变只有一个:At1g15510基因第1931位碱基由G变为A,即ECB2蛋白的Gly644转变为Asp644。从Tair网(拟南芥信息资源网站https://www.arabidopsis.org/)下载At1g15510基因序列,选取基因上游1936 bp的启动子序列和基因全长2601 bp序列构建互补载体。通过浸花法侵染该突变体,经过筛选最终得到了表型恢复为野生型的互补植株。证明了该突变体表型是由At1g15510基因的突变造成的,故我们将该突变体命名为ecb2-3。2.At ECB2基因是PPR家族的一员根据拟南芥PPR蛋白数据(http://www.plantenergy.uwa.edu.au/applications/ppr/ppr.php),At ECB2蛋白属于PPR蛋白家族PLS亚家族的DYW亚类,包含17个PPR基序。通过对不同物种的ECB2同源蛋白序列对比,发现ecb2-3中被突变的Gly是非保守性氨基酸。3.ecb2-3突变体叶绿体发育受到抑制由于ecb2-3突变体的叶片延迟变绿表型,我们对突变体进行叶绿素含量和最大光化学效率的测定,结果显示突变体绿色叶片叶绿素含量和最大光化学效率与野生型无明显差异,黄色叶片存在显著性差异。同时也通过透射电镜对突变体叶绿体超微结构进行观察,结果显示萌发后7天的ecb2-3子叶的叶绿体小于同时期野生型叶绿体。在萌发后21天的ecb2-3植株中,黄色真叶的叶绿体缺乏类囊体膜和淀粉颗粒,与预期相同,绿色真叶的叶绿体含有与野生型相似的类囊体膜和淀粉颗粒。同样在互补植株中,叶绿体与野生型植物具有相似的超微结构。4.ecb2-3突变体acc D和ndh F的RNA编辑效率有所下降有文献报道,At ECB2参与拟南芥叶绿体基因acc D(C794和C1568)和ndh F(C290)的RNA编辑。我们通过提取Col-0野生型ecb2-3突变体RNA,反转录为c DNA,以c DNA设计合适的引物将acc D和ndh F的编辑位点扩增下来进行测序,同时设计d CAP引物进行PCR反应分析其编辑效率。结果显示:与野生型相比,突变体在这三个位点的编辑效率均存在不同程度的降低,但是并没有完全消除。以上结果表明At ECB2是拟南芥叶绿体acc D基因和ndh F基因RNA编辑和早期发育所必需的。而正是因为ecb2-3突变体具有完整的生活史和其能够稳定遗传的生理特性使该突变体可用于在拟南芥RNA编辑和叶绿体发育的进一步研究中。