化石能源的枯竭是当今世界面临的一个重要问题,为了缓解能源危机,开发新能源已是大势所趋,利用生物技术生产液体燃料就是一个重要的途径。目前主要有三个平台可以将生物质转化为液体燃料,分别是热化学平台、糖平台和羧酸平台,其中羧酸平台是能量转化率最高的平台。作为羧酸平台中的重要菌株,克氏梭菌(Clostridium kluyveri)可以发酵产生中链脂肪酸和醇,并能通过独特的链延伸机制—逆β氧化反应—延长短链脂肪酸的碳链,产生具有较高能量密度更适合作为生物燃料和化学前体物的中链脂肪酸(MCFAs,C5-C8)。虽然该菌株已经被广泛研究,但其发酵生理机制至今尚不完全清楚。因此,本论文主要对克氏梭菌产酸的链延伸生理机制和产醇生理机制进行了初步研究。克氏梭菌可以发酵乙酸和乙醇生产丁酸和己酸,具体的代谢途径已有报道。另外文献报道克氏梭菌还能利用丙酸和丁酸。为了确定克氏梭菌在这几种不同底物下是否利用相同的链延伸反应酶系,本论文首先采用三种不同底物乙酸、丙酸、丁酸分别与乙醇混合发酵,利用GC-MS鉴定发酵产物的种类,再进一步通过HPLC检测发酵底物和产物含量随时间的变化,其中以乙酸为底物最多可生成2.64 g/L 丁酸、8.2 g/L己酸和0.46 g/L辛酸;以丙酸为底物发酵不仅生成了 5.1 g/L戊酸和1g/L庚酸,还生成了 1.87 g/L的己酸和1.1 g/L的辛酸;以丁酸为底物发酵则生成了 7 g/L己酸和1.1 g/L辛酸。通过上述发酵实验结果可以发现不同底物下的产物都符合预期的逆β氧化机制,而丙酸底物下发现的偶数链脂肪酸推测是乙醇氧化产生的。有趣的是在分析丁酸合成的基因簇crt1-bcd1-etfAB1-hbd1-nfnAB时发现其上游有一个编码转录调控蛋白Rex的基因,文献报道Rex是一个氧化还原感应转录调控蛋白,它能感应胞内的NADH/NAD+比率变化来调控相关基因的转录,因此推测它可能对克氏梭菌发酵代谢尤其是链延伸反应有调控作用。为了研究Rex蛋白的具体功能以及受它调控的基因,首先利用生物信息分析在调控蛋白数据库(RegPredict)中找到可能受到Rex调控的基因,整理后发现Rex可能调控的基因涉及丁酸、丁醇的合成和乙醇的氧化等代谢途径,还有能量代谢和电子转移方面的基因,另外Rex还可能调控其他的转录调控子以及进行自我调控。接着对Rex进行异源表达和纯化,通过凝胶阻滞实验(EMSA)和等温滴定量热实验(ITC)验证Rex与相关基因启动子区域的结合能力、结合常数以及NADH/NAD+对结合反应的影响。结果发现Rex可以结合丁酸合成途径中关键酶的基因crt1、cat3和thlA3以及其它一些重要基因的启动子区域,ITC实验也成功得到了结合常数,另外NADH/NAD+对Rex和核酸的结合的确有很大的影响。这些结果显示,Rex在克氏梭菌中起着全球转录阻遏蛋白的作用。克氏梭菌在不同生长时期的氧化还原状态不同,为了进一步验证Rex在不同氧化还原状态下对基因转录的调控作用,本论文对克氏梭菌在乙酸底物下生长前期和生长后期进行转录组测序分析。另外通过发酵实验发现克氏梭菌在不同底物下产酸都符合链延伸机制,为了研究克氏梭菌在不同底物下是否利用同一套基因进行链延伸反应,对克氏梭菌在乙酸、丙酸、丁酸三种底物下进行转录组测序分析。通过不同生长时期的转录分析发现一些可能受Rex调控的基因的转录水平在生长前期和后期的确有较大的差异。通过不同底物下的转录分析找到了在不同底物下发挥主要功能的基因,比如丙酸底物下hbd2基因的表达量显著提高。此外,分析转录组发现克氏梭菌可能存在另一条链延伸途径——由两个二氧化碳延伸成为乙酸的途径:一分析二氧化碳经过一系列反应生成甲基类咕啉,再和另一分子二氧化碳形成的一氧化碳反应生成乙酰CoA,再生成乙酸。这个推测还需要进一步实验验证。根据转录组分析的结果,本论文进一步对产酸途径中的一些基因进行了功能验证。首先是克氏梭菌链延伸反应中的关键酶3-羟基丁酰CoA脱氢酶(Hbd),基因组分析发现克氏梭菌含有两个不同的Hbd,一个注释为NADPH依赖的Hbd1,另一个注释为NADH依赖的Hbd2。异源表达和纯化后以乙酰乙酰CoA为底物对这两个酶进行酶活测定,结果发现Hbd1的确为NADPH依赖型,以NADPH为底物的比活远远高于以NADH为底物的比活,而Hbd2对NADH和NADPH都基本没有酶活,推测是Hbd2的最适底物不是乙酰乙酰CoA;检测不同底物下生长的克氏梭菌粗酶液中Hbd的酶活,并结合转录组分析结果,推测Hbd2对奇数碳链底物的亲和性更高。同时在粗酶液中还检测到了电子歧化酶NfnAB的活力,确定了克氏梭菌胞内NADPH的来源。另外为了测定NfnAB的酶活,对其反应底物铁氧化还原蛋白(来自巴斯德梭菌)进行了高效异源表达,经优化,表达纯化后的产量远远高于野生菌中的产量,其中[2Fe2S]型铁氧化还原蛋白每升培养物产量约40 mg,2[4Fe4S]型铁氧化还原蛋白每升培养物产量可以达到3.7 mg,为铁氧化还原蛋白的生产提供了新的来源。早期文献报道在克氏梭菌的发酵液中检测到了醇类化合物,但是没有深入研究,具体的生化途径也不清楚,因此本论文开展了对克氏梭菌产醇实验的研究。GC-MS测定发现克氏梭菌以乙酸为底物发酵产生了丁醇、己醇和辛醇三种醇。同时通过气相色谱检测了不同底物下醇的产量,其中以乙酸为底物生成了约11.9μg/L丙醇,12.8 μg/L 丁醇以及8.3 μg/L的己醇;以丙酸为底物发酵产生了约0.98 mg/L丙醇,15.9μg/L 丁醇以及6.7μg/L戊醇;以丁酸为底物发酵产生了约95μg/L丙醇,19.8μg/L 丁醇以及14.7μg/L的己醇。综合转录组数据和其他梭菌的报道,推测醇是由酸还原产生的,并提出几条可能的产醇途径,对可能参与醇合成途径的基因进行异源表达和功能验证,最后确定了产丁醇的一个途径:通过双功能酶Aad催化,将丁酰CoA还原为丁醛后进一步还原生成丁醇。综上所述,本论文对克氏梭菌链延伸发酵产酸和产醇的机制进行了初步研究。克氏梭菌通过链延伸可以发酵生成从C3(丙酸)到C8(辛酸)的中链脂肪酸,并可进一步生成从C3(丙醇)到C8(辛醇)的中链醇。转录组分析和Rex调控蛋白的生物信息分析及体外实验分析显示,链延伸产酸基本使用了合成丁酸的酶系,但也可能根据底物链长使用不同的酶如Hbd2。Rex作为全球转录调控蛋白对链延伸的关键基因(簇)起到严格的调控作用,如crt1-bcd1-etfAB1-hbd1-nfnAB和cat3等。而产醇则可能具有多条途径,其中部分基因如bdh2也受Rex调控,其中还原酸产醇途径经本论文实验验证为重要的产醇途径。本论文证明克氏梭菌在生产中链脂肪酸和中链醇具有重要的应用价值,在国内外首次对其链延伸的机制展开详细的转录组分析研究,揭示了其中的一些新机制。这些结果为理解克氏梭菌链延伸发酵的生理机制提供了新的认识。本论文还有许多的不足之处,例如转录组数据还有待于更深入的分析,没有对rex基因进行敲除,所以对它的功能研究还并不完善;此外,产醇途径中还有几个蛋白因为形成包涵体而没有纯化成功,需要改进诱导条件获得可溶性的蛋白。