据世界卫生组织统计,癌症已成为全球第二大死因,从全球情况看,近六分之一的死亡是由癌症造成。近年来,随着免疫疗法的迅猛发展与取得的一系列重大突破,针对传统肿瘤疗法的不足,为一些恶性肿瘤的治疗提供了新的思路与方向。巨噬细胞作为维持机体内环境稳态、抵御外来病原体的重要先天免疫细胞,具有高度可塑性。大量研究表明,肿瘤浸润巨噬细胞(TIM)是肿瘤微环境(TME)中一种重要的炎症细胞,依据功能表型不同,大致分为M1型和M2型。M1巨噬细胞主要表现出促炎和抗肿瘤作用,而M2巨噬细胞则表现出抗炎和促肿瘤活性。如果可以有目的地调节巨噬细胞,抑制巨噬细胞表达M2型的免疫抑制作用,上调M1型的抗原呈递和免疫激活功能,就有可能使机体发挥免疫功能来识别并杀死肿瘤细胞,起到肿瘤防治的目的。有研究表明,细菌感染可激活免疫细胞识别肿瘤抗原,引起免疫反应杀死肿瘤细胞,但长期感染可增加炎症因子和细胞,以促进肿瘤的进展和转移。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁主要成分,也是诱导巨噬细胞向M1型活化的经典诱导剂。褪黑素参与调节广泛的生理功能,对免疫系统具有多效性。本研究的目的是观察褪黑素联合LPS,能否解除LPS长期应用带来的免疫抑制,促进M1型巨噬细胞持续极化,产生肿瘤防治作用。本研究分体外、体内和机制研究三部分。体外研究中,首先,用LPS单次诱导RAW264.7细胞使其极化为M1型巨噬细胞,用IL-4诱导RAW264.7细胞使其极化为M2型巨噬细胞;用LPS连续7天诱导巨噬细胞,免疫荧光检测巨噬细胞表型变化;MTT检测不同浓度褪黑素对M1型和M2型巨噬细胞增殖的影响;与Lewis肺癌细胞(LLC)共培养检测杀伤活性;激光全息检测褪黑素对巨噬细胞体积的影响;中性红和细菌吞噬实验分析巨噬细胞识别及吞噬能力。体内研究中,建立乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型,记录实验小鼠体重、肺部结节数;伊文思蓝染色检测肺血管通透性;免疫荧光检测褪黑素与LPS单独或连用对肺组织巨噬细胞表型及NK细胞的影响,评价褪黑素与LPS对肺癌的预防作用。接着建立H22肝癌腋下移植模型,记录荷瘤小鼠瘤重、瘤体积;伊文思蓝染色检测肿瘤血管通透性;检测过继性输注M1和M2巨噬细胞对肿瘤生长的作用,以及褪黑素与LPS治疗对肿瘤生长的作用;免疫组化检测肿瘤内巨噬细胞和NK细胞表型。最后建立免疫再攻击模型,记录荷瘤小鼠瘤重、瘤体积;伊文思蓝染色检测血管通透性;免疫荧光检测褪黑素与LPS单独或连用对肺组织巨噬细胞表型及NK细胞的影响,评价褪黑素与LPS对肿瘤的预防作用。研究褪黑素联合LPS调控巨噬细胞表型防治肿瘤的机制,首先对褪黑素相关靶点和M2巨噬细胞极化涉及的途径进行了全面的生物信息学分析,经过评分优化筛选出PI3 K/AKT和Jak/Stat3两条核心信号通路。在体外,免疫荧光检测自噬蛋白LC3-B、P62表达;DCFH-DA检测细胞内ROS功能;Filipin检测细胞膜脂筏;共培养检测巨噬细胞对NK细胞功能的影响;Western blot检测巨噬细胞与NK细胞中PD-L1、PD-1、Jak2、Stat3和p AKT表达。在乌拉坦诱导的肺癌模型中,ELISA检测血清与肺泡灌洗液中TNF-α、IFN-γ、ROS、NO、PD-L1、IL-2、IL-10、TGF-β1水平。免疫荧光与免疫组化检测LEC、LPS与褪黑素单独或联用对肺组织中巨噬细胞表型、NK细胞活性与肺组织血管通透性的影响。在H22肝癌同种异体移植模型中,免疫荧光检测LEC、LPS与褪黑素单独或连用对肿瘤内巨噬细胞、NK细胞表型,评价褪黑素联合LPS对巨噬细胞表型维持作用。为了进一步了解LPS在肿瘤免疫耐受中的作用,本文也评估了细菌感染和癌症患者生存的临床关联度。体外结果显示,巨噬细胞经过LPS连续多次诱导,会使极化为M1型的巨噬细胞产生LPS耐受转变为M2型。M1巨噬细胞对LLC具有杀伤活性,但M2促进LLC增殖。褪黑素在10u M/m L时不改变M1极化表型,可降低M2型巨噬细胞的吞噬能力,同时解除由M1型巨噬细胞发生LPS耐受,使巨噬细胞维持M1型。进行体内研究的结果表明,使用化学诱导剂乌拉坦诱导小鼠肺癌模型中,肺组织中M2型巨噬细胞浸润程度跟肺癌进展的程度与呈正相关。LPS组经过连续给药增加了M2巨噬细胞比率,降低了M1巨噬细胞比率,促进了肺癌的发生。褪黑素增加肺组织中M1巨噬细胞比率,降低M2巨噬细胞比率,显著降低肺部肿瘤结节数,表现出抗肺癌作用。LEC删除巨噬细胞对乌拉坦诱导的肺癌有明显防治作用。褪黑素和LPS联用可逆转LPS的促肿瘤作用,显著增加M1巨噬细胞比率,降低M2巨噬细胞比率,对肺癌发生表现出明显的协调预防作用。在H22肝癌同种异体移植模型中,LPS表现出明显的抗肿瘤作用,阻止过继性输注M2巨噬细胞的促肿瘤作用,与过继性输注M1巨噬细胞协同阻止肿瘤增殖,同时增加肿瘤内记忆性NK细胞比率,减少PD-1+NK细胞比率,但单用褪黑素没有表现出明显的抗肿瘤作用。在免疫再攻击模型中,LPS降低M1巨噬细胞比率,增加M2巨噬细胞比率,增加PD-1+NK细胞比率,降低了记忆性NK细胞比率,表现出促肿瘤生长,但与褪黑素联用则可逆转LPS的促肿瘤作用,体现出抗肿瘤作用。机制研究表明,褪黑素可促进M2巨噬细胞自噬,增加其ROS水平,M2巨噬细胞相比M1具有更高细胞膜脂筏表达,褪黑素可降低其细胞膜脂筏表达。M1巨噬细胞增强NK细胞的LLC清除功能,M2促进NK细胞自身PD-1表达,降低了NK细胞的LLC清除功能。Western blot结果显示M2巨噬细胞高表达PD-L1、p AKT及STAT3,褪黑素可降低其蛋白表达。在乌拉坦肺癌模型中,LPS诱导肺组织中CD163、CD31及PD-1高表达,血管通透性增加,记忆性NK细胞比率降低,增加肺泡灌洗液中IL-10、TGF-β1和ROS水平;褪黑素诱导肺组织中CD86高表达,降低肺组织血管通透性,增加记忆性NK细胞比率,增加肺泡灌洗液中TNF-α、IFN-γ和IL-2水平,褪黑素与LPS联用可逆转LPS的促肿瘤作用。在H22肝癌同种异体移植瘤模型中,LPS促进诱导CD86+巨噬细胞的生成,增加记忆性NK细胞比率,表现出显著的抗肿瘤作用,褪黑素联合LPS增强了抗肿瘤作用,但褪黑素单独使用对于肿瘤的生长不能起到显著作用。在免疫再攻击模型中,LPS组产生了LPS免疫耐受,M1巨噬细胞比率降低,M2巨噬细胞比率增加,PD-1+NK细胞比率增加,同时降低了记忆性NK细胞比率,表现出促肿瘤生长,但与褪黑素联用则可逆转LPS的促肿瘤作用,体现出抗肿瘤作用。对细菌感染和癌症患者生存的临床关联度进行了Meta分析,分析显示,细菌感染增加了癌症发生的风险,并与癌症存活率呈负相关,提示LPS耐受在癌症进展中具有广泛的作用。综上所述,巨噬细胞跟肿瘤发生发展密切相关,M2巨噬细胞对于肿瘤的进程起到促进作用。巨噬细胞经过LPS连续诱导使极化的M1产生LPS耐受转化为M2巨噬细胞,褪黑素与LPS联用解除由M1型巨噬细胞发生LPS耐受,使巨噬细胞维持M1型,其机制跟抑制PI3 K/AKT和Jak/Stat3两条信号通路密切相关。