论文部分内容阅读
背景:神经血管单元由神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞三部分共同组成,此定义的提出强调了三者及其相互联系在神经系统中的重要地位。缝隙连接实现了细胞群信息传递、代谢底物交换和离子平衡上的同步化,并且在神经元兴奋性、血管舒缩及内环境稳态的调节中发挥了重要作用。在神经系统中缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)为缝隙连接的最主要组成成分。缺血性脑损伤主要是由于局部脑血流中断,组织缺氧,其代谢功能无法正常运转,导致以神经元为主,胶质细胞及血管内皮细胞共同组成的神经血管单元受损,最终机体的功能受到破坏。近来发现,在星形胶质细胞的线粒体上也存在Cx43的表达,但是其在缺血性脑损伤过程中的变化及所扮演的角色尚未探知。鉴于线粒体在能量代谢、信号转导、蛋白磷酸化等方面的重要作用,我们选择以缝隙连接蛋白——特别是分布于线粒体内膜上的Cx43的分布变化及功能为研究对象,拟通过分析其在缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)损伤中变化规律及作用机制,探索干预线粒体缝隙连接对神经保护的意义,为脑梗塞的治疗提供新的靶点。目的:观察线粒体内Cx43的分布及表达变化,分析其在脑IR损伤中变化规律,进一步探索相关作用机制,同时评价丹参多酚酸的保护作用。方法:体外实验中,以原代培养的星形胶质细胞糖氧剥夺模型(oxygen glucose deprivation,OGD)为基础,实验分为对照组,单纯OGD组(模型组),缝隙连接通道阻断剂—甘珀酸(carbenoxolone,CBX)干预组,线粒体ATP敏感性钾通道激动剂—二氮嗪(diazoxide,DZX)干预组,DZX+线粒体ATP敏感性钾通道抑制剂—5-羟奎酸(5-hydroxydecanoic acid,5-HD)干预组和丹参多酚酸(salvianolic acid,SA)干预组。首先,检测各干预剂下细胞的相对存活率,同时分析各组细胞凋亡情况,电镜下观察各组细胞及细胞内线粒体形态。进而,检测各干预剂刺激下线粒体膜电位的变化,通过免疫荧光定位观察星形胶质细胞中Cx43的分布情况。体内实验中,选用体重约为250~290 g的雄性Wistar大鼠,采用左侧大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。实验分为假手术组(对照组)、单纯IR组(模型组)、CBX干预组、DZX干预组、DZX+5-HD干预组、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制剂—Ro-31-8425+DZX干预组、PKC激动剂—佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)+5-HD干预组和SA干预组。首先,染色观察比较各干预药物对大鼠脑梗死面积、神经功能学评分的作用,评价各干预药物对大鼠脑梗塞后凋亡情况的影响,继而观察脑皮层梗死区线粒体形态,同时通过超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的检测评价各干预剂下线粒体功能的变化,最后对脑皮层梗死区Cx43、p-Cx43、PKC、p-PKC蛋白的表达含量进行定量,探讨不同干预剂的不同作用,分析其机制。结果:1、组织、细胞形态学:与单纯模型组比,CBX和DZX干预组脑梗死面积明显减小,细胞的凋亡程度降低(P<0.01),且5-HD降低了DZX对梗死面积的缩小作用(P<0.01);同样与模型组相比,SA组明显减少了梗死面积,降低了细胞凋亡程度(P<0.01)。2、神经功能学评分:与对照组比较,其余各组评分均增高(P<0.01),表现为梗塞区对侧的肢体肌力降低,但除对照组外,其余各组之间评分无显著差异。3、线粒体形态及功能:线粒体形态方面,与对照组相比,其余各组脑皮层梗死区线粒体形态损伤明显,主要表现为线粒体肿胀,棘断裂,基质透明化,其中单纯模型组和DZX+5-HD组线粒体损伤较明显(P<0.05);线粒体功能方面,与假手术组比较,单纯模型组可见明显的SOD活力减低、MDA含量增高(P<0.01),而CBX、DZX、PMA、SA干预剂皆能一定程度上提高SOD活力、降低MDA含量(P<0.05),对线粒体功能起到保护作用。4、Cx43定位与定量:与对照组比,单纯OGD组星形胶质细胞整体Cx43含量减低,特别是细胞膜上分布含量减低,而细胞内Cx43的含量趋近增多,并且可见线粒体与Cx43共定位;在线粒体蛋白定量中,与假手术组比,模型组脑皮层梗死区线粒体Cx43、p-Cx43含量明显减低(P<0.01),而p-Cx43降低更为明显(P<0.01),在CBX、DZX、PMA、SA干预调节下,与IR组比,线粒体Cx43、p-Cx43明显升高(P<0.05),且p-Cx43增高更为明显(P<0.05)。结论:线粒体Cx43可以在脑IR损伤中起到保护神经血管单元的作用,这种保护作用是通过线粒体ATP敏感性钾通道调节PKC活性实现的,并且线粒体Cx43也参与了丹参多酚酸对脑IR损伤的保护过程。