背景:缺血性脑卒中,是当前全球主要致死致残的疾病之一。目前主要治疗方法为静脉溶栓。但是治疗的时间窗非常严格,常因起病急、未及时送医而失去救治机会,且还有部分患者溶栓后没有获得改善。总之,缺血性脑卒中亟待新的治疗方法。而免疫治疗在肿瘤中的成功应用也给缺血性脑卒中的治疗带来了新的启示。临床观察到升高的中性粒细胞的比例,与中风的严重程度和预后密切相关。动物实验也发现患侧脑区出现中性粒细胞的升高,且中性粒细胞的数量随时间而发生显著的动态变化。但是这些研究均集中在缺血性脑卒中的急性期,而对它的亚急性期和慢性期涉及较少。鉴于一些研究发现中性粒细胞与急慢性炎症密切相关,且显示出高度异质性,那么有理由推断中性粒细胞在缺血性脑卒中的亚急性期、慢性期也发挥作用。中性粒细胞在缺血性脑卒中的长期病程中具体发生怎样的变化和作用,尤其是其亚群的变化还未可知。最近有小鼠急性缺血性脑卒中的单细胞转录组学研究,获取样本时间分别为24小时、5天、7天,没有其他长程时间点,他们关注的细胞类型也并非中性粒细胞。通过对覆盖急性期、亚急性期、恢复期等全病程的缺血性脑卒中再灌注小鼠模型的患侧大脑半球进行单细胞转录组测序分析,能够揭示与缺血性脑卒中相关的中性粒细胞亚型以及它们随时间的动态变化,从而为缺血性脑卒中的治疗提供新的思路。目的:1.绘制中性粒细胞在缺血性脑卒中发病后浸润脑组织中性粒细胞的单细胞图谱。2.探讨中性粒细胞亚群在缺血性脑卒中病程中的异质性与生物学功能及其与卒中进展变化的关系。3.鉴定调控中性粒细胞亚群分化的关键转录调控因子。方法:构建雄性C57小鼠大脑中动脉线栓梗塞模型。分别在造模前和脑缺血再灌注第3、14、40、110天各取两只小鼠缺血半球的脑组织,制备单细胞悬液,利用CD45磁珠进行细胞分选,同时利用10×单细胞转录组文库构建试剂盒制备单细胞文库并进行Illumina PE150二代测序。利用Cellranger 5.0对二代测序的单细胞文库的fastq文件进行基因比对,获得Count矩阵,利用R中的Seurat包对单细胞计数矩阵进行降维、聚类,根据细胞类型特异性marker和高表达基因,对中性粒细胞亚群进行注释,明确中性粒细胞在缺血性脑卒中模型中的异质性及其与疾病进展的相关性。利用GO/KEGG/GSEA分析各中性粒细胞亚群的功能,同时利用PPI蛋白互作分析,明确各亚群中性粒细胞的基因互作网络。利用多重免疫荧光染色验证关键中性粒细胞亚群在病灶中的变化并探讨其空间分布。利用Monocle2和SCENIC分别对中性粒细胞亚群进行拟时序分析和转录调控网络分析,明确各亚群的分化轨迹及关键转录调控因子。利用公共单细胞转录组数据验证脑缺血模型的中性粒细胞的变化。利用公共Bulk-seq数据验证中性粒细胞高表达基因的可靠性。结果:1.中性粒细胞在缺血性脑卒中病灶中长期存在,共鉴定到5类中性粒细胞细胞亚群,分别为 Neut-Klh16、Neut-G0s2、Neut-Lgals3、Neut-Tnf、Neut-Cd177,绘制了浸润脑组织中性粒细胞的单细胞图谱;2.富集分析提示 Neut-Tnf 亚群在 TNF-a、NF-kB、Nod-like、IL-17 等促炎通路显著富集,而Neut-Lgals3亚群主要富集溶酶体和吞噬体通路,可能在清除坏死病灶,重塑缺血病灶中发挥重要作用;3.Neut-G0s2亚群在病程中保持较高数量,持续存在,多色免疫荧光证实其在缺血脑组织中数量明显增多,GSEA富集到其具有分化能力,拟时序分析发现Neut-G0s2处于拟时序中间,而Neut-Tnf亚群和Neut-Lgals3亚群分属拟时序的两端,据此Neut-Tnf亚群和Neut-Lgals3亚群是由Neut-G0s2分别向两个方向分化而来。4.蛋白质网络分析显示Lgals3是Neut-Lgals3亚群的核心基因,转录因子分析结果显示Mfag/Usf2是Lgals3的转录因子,且处于转录因子排序的较高位置,所以Mfag/Usf2是调节Neut-Lgals3亚群分化的关键调控因子;5.蛋白质网络分析显示Tnf、Nfkbia是Neut-Tnf亚群的核心基因,转录因子分析显示Nfkb1是Tnf、Nfkbia的转录因子,且Nfkb1处于转录因子排序的较高位置,所以Nfkb1是调节Neut-Tnf亚群分化的关键调控因子;6.公共单细胞转录组数据提示正常小鼠脑组织不存在Neut-Lgals3亚群,该亚群为缺血性脑卒中后新分化中性粒细胞亚群;7.公共Bulk-seq数据证实在Neut-G0s2亚群高表达的的Tnf、Nfkbia、Icam1、Nlrp3等基因和在Neut-Lgals3亚群高表达的Lgals3、Spp1、Apoe等基因与脑缺血相关。结论:1.中性粒细胞在缺血性脑卒中病灶中长期存在,共鉴定到5类中性粒细胞细胞亚群,分别为 Neut-Klhl6、Neut-G0s2、Neut-Lgals3、Neut-Tnf、Neut-Cd177,各细胞亚群在脑缺血病灶中的比例具有明显的异质性;2.Neut-G0s2亚群和Neut-Cd177亚群在对照组和所有的模型组中都有发现;Neut-Klh16亚群和Neut-Tnf亚群则大都出现在缺血后3天;而Neut-Lgals3亚群只存在于模型组中,其高峰于缺血后14天时出现,此后该亚群持续存在;3.Neut-G0s2亚群、Neut-Tnf亚群、Neut-Lgals3为缺血性脑卒中主要的组织浸润中性粒细胞亚群,其中Neut-G0s2亚群为向促炎表型的Neut-Tnf亚群或组织修复表型的Neut-Lgals3亚群分化的关键节点;4.Nfkb1和Mafg/Usf2分别调控缺血性脑卒中组织浸润中性粒细胞向促炎表型和组织修复表型分化;5.Neut-Tnf亚群在缺血性脑卒中的急性期发挥促炎作用,Neut-Lgals3亚群为缺血性脑卒中后新分化的中性粒细胞亚群,并在缺血性脑卒中慢性期长期存在。