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目的后发性白内障(posterior capsule opacification,PCO),是现代白内障超声乳化联合人工晶状体植入术后最常见的并发症,也是导致患者术后视力再次下降的主要原因。目前认为白内障术后残留的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)增殖、迁移、上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及细胞外基质沉积是PCO发病的主要原因。目前最有效的治疗方法是利用Nd:YAG激光将后囊膜切开,但是此种方法可能引起黄斑水肿、视网膜脱离等并发症。本研究拟探讨PCO的发病机制,为PCO的诊疗策略提供新的思路。转化生长因子-β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)被认为是诱导LECs转分化最强劲的细胞因子,通过抑制TGF-β信号通路从而抑制晶状体上皮细胞增殖和转分化,这可能为后发性白内障提供新的治疗方法。Smad3是TGF-β/Smad信号传导通路的关键分子,为阐明TGF-β/Smad3信号通路对于PCO发病过程中LECs生物学作用的精确调控,本项研究拟通过细胞实验及动物模型明确TGF-β/Smad3信号通路在LECs诱导PCO形成过程中的调控作用机制。方法第一部分:细胞实验,运用重组TGF-β2诱导活体外晶状体上皮细胞(HLE-B3)PCO模型,在培养基中分别加入/不加入Smad3抑制剂SIS3,运用CCK-8实验检测晶状体上皮细胞的存活率,以及Western blot验证SIS3对Smad3的抑制作用。实验分组:A:正常对照组;B:阴性对照组:添加DMSO;C:TGF-β2组;D:TGF-β2+SIS3组。运用RT-PCR技术检测EMT过程中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、转录因子Snail1和Slug、上皮标记物E-钙黏蛋白、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)以及collagen type I的mRNA的相对表达量;利用免疫荧光技术检测原位FN和E-钙黏蛋白的表达。第二部分:动物模型实验,采用26G皮下注射针头刺破C57BL/6J小鼠晶状体前囊膜来诱导晶状体上皮-间质转化,为下一步实验提供模型基础。1、组织学观察小鼠晶状体前囊膜损伤愈合情况。2、实时荧光定量PCR技术检测小鼠晶状体前囊膜损伤后α-SMA、CDH1(E-钙黏蛋白)、lumican、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、FN、collagen type I的mRNA的相对表达量。3、免疫荧光染色技术检测小鼠晶状体前囊膜损后α-SMA、lumican、FN原位蛋白的表达。第三部分:利用Smad3基因敲除鼠(Smad3 knocout,Smad3 KO/Smad3-/-)和野生型小鼠(wide type,WT/Smad3+/+)建立晶状体前囊膜损伤模型,进一步在活体内研究Smad3缺失对于晶状体上皮间质转化的影响。1、组织学观察比较Smad3 KO和WT小鼠晶状体前囊膜损伤愈合情况。2、实时荧光定量PCR技术检测Smad3 KO和WT小鼠晶状体损伤后α-SMA、Snail1、Slug、Twist1、SIP1、E-钙黏蛋白、lumican、OPN、透明质酸酶(Hyaluronidases,HASs)、FN、collagen type I的mRNA的相对表达量。3、Western blot方法检测Smad3 KO和WT小鼠晶状体损伤后α-SMA、lumican、OPN、FN蛋白水平的表达差异。4、免疫荧光染色技术检测Smad3 KO和WT小鼠晶状体损伤后Smad3 KO和WT小鼠中α-SMA、E-钙黏蛋白、lumican、OPN、透明质酸(hyaluronic acid,HA)、FN、collagen type I原位蛋白的表达差异。5、TUNEL法检测Smad3 KO和WT小鼠的细胞凋亡数量。结果1、体外实验显示,当SIS3终浓度为3μM时,SIS3能有效的抑制p-Smad3的表达,对Smad3的抑制作用最强。2、SIS3有效抑制转录因子Snail1和Slug的表达,下调α-SMA的表达,上调E-钙黏蛋白,抑制细胞外基质纤维连接蛋白和collagen type I的表达。3、利用26G针头刺破晶状体前囊膜实验,结果表明术后α-SMA、lumican、OPN、FN、collagen type I表达增加,E-钙黏蛋白表达下降,成功诱导小鼠晶状体上皮转分化,该方法具有操作简单、安全、可重复性高、成本低的特点,为下一步体内实验提供基础。4、体内动物实验结果显示,Smad3缺失可抑制α-SMA、转录因子Snaill、Slug、Twist1、SIP1表达,促进E-钙黏蛋白表达,抑制lumican、OPN、HA、FN、collagen type I等细胞外基质表达。结论本研究通过细胞实验和动物模型实验证明TGF-β/Smad3参与调控晶状体上皮细胞间质转分化;Smad3是TGF-β/Smad3信号通路的关键靶点;阻断Smad3可以抑制该信号通路对晶状体上皮细胞的转分化;Smad3可能是后发性白内障和前囊下白内障等纤维化疾病的潜在治疗新思路。