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背景:氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是血脂的主要活性成分,血液中脂质含量增加,尤其是ox-LDL含量过高可直接损伤动脉内皮,内皮下脂质沉积是动脉粥样硬化血栓形成的始动环节。血小板活化和聚集是血栓形成的重要步骤,研究血小板的激活机制和血小板在动脉血栓形成中的作用对防治动脉血栓形成和降低心血管病死亡率具有重要意义。因此,探讨ox-LDL对血小板功能的影响对研究动脉粥样硬化血栓形成的机制显得尤为必要。有研究表明,ox-LDL有促进血小板活化的功能,但其具体作用方式并不明确。本文通过体外实验着重研究ox-LDL对血小板活化和凋亡的影响,进一步了解ox-LDL对血小板的作用。目的:本研究在体外条件下,探索ox-LDL对血小板活化和凋亡的影响,进而探讨ox-LDL是否通过影响血小板功能从而进一步促进血栓形成。方法:采集健康人血制备洗涤血小板,用不同浓度的ox-LDL(25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)与洗涤血小板共孵育30分钟,检测血小板表面P选择素和CD40L的表达情况以及活性氧(ROS)的产生。用ox-LDL(50μg/ml)与洗涤血小板共孵育96小时,检测不同时间点时(0h,24h,48h,72h,96h)血小板线粒体膜电位(Δψm)去极化程度和磷脂酰丝氨酸(PS)外翻情况。用不同浓度的ox-LDL(25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)预先孵育血小板5分钟,再检测ADP(5μg/ml)刺激下血小板的聚集率。不同浓度的ox-LDL(25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)孵育血小板30分钟后,裂解血小板,用western blot的方法检测血小板内PI3k/AKt信号通路相关蛋白的含量。结果:1.ox-LDL预孵育血小板后增加ADP诱导的血小板最大聚集率:与对照组相比,ox-LDL预处理后,ADP诱导的血小板最大聚集率增加(P<0.05)。表明ox-LDL能够提高血小板活性,促进ADP诱导的血小板聚集。然而,三组ox-LDL组组间比较时,随着ox-LDL剂量的增加,血小板最大聚集率无明显差异(P>0.05)。2.不同浓度的ox-LDL孵育后血小板表面活性物质的表达:我们发现,与对照组相比,ox-LDL孵育后的血小板表面P-选择素和CD40L的表达显著增加(P<0.05),表明ox-LDL具有促进血小板活化的作用。然而,不同浓度的ox-LDL组组间比较时,血小板表面P-选择素和CD40L的表达没有明显差异(P>0.05)。3.ox-LDL预孵育后增加血小板中活性氧(ROS)的产生:与对照组相比,三组不同浓度的ox-LDL均能促进血小板中ROS的产生(P<0.05)。同时,三组ox-LDL组组间比较发现,随着ox-LDL浓度的增加,ROS的产生随之增加,呈现剂量依赖关系,组间差异有统计学意义(P<0.05)。4.ox-LDL对血小板凋亡指标的影响:我们发现与对照组相比,ox-LDL在短时间内(0 h,24 h,48 h)对血小板线粒体膜电位(Δψm)去极化程度以及磷脂酰丝氨酸(PS)外翻改变不明显(P>0.05)。随着共孵育时间的延长,72h,96h的结果显示,血小板线粒体膜电位去极化和PS外翻比对照组明显增加(P<0.05)。线粒体膜电位去极化和PS外翻是血小板的凋亡指标,由此表明ox-LDL对血小板凋亡的作用短期(48h以内)不明显,长时间刺激血小板可引起其发生凋亡。5.ox-LDL处理后血小板中PI3k,AKt和p-AKt的表达:Western blot结果显示,与对照组相比,ox-LDL与血小板共孵育后,血小板p-AKt的表达明显增多(P<0.05),且不同浓度的ox-LDL组间比较显示,ox-LDL浓度越高,p-AKt的表达越多。而ox-LDL组PI3k和AKt的表达与对照组相比无明显差异(P>0.05)。结论:体外实验证明,ox-LDL与洗涤血小板共孵育后,能增加ADP诱导的血小板最大聚集率,促进血小板表面活性物质如P-选择素和CD40L的表达,同时增加血小板内ROS的产生,表明ox-LDL能够使血小板处于高活性状态,诱导血小板活化。此外,ox-LDL与血小板共孵育30min即可诱导其活化,长时间(超过72h)共孵育,才可诱导血小板凋亡,表明ox-LDL主要影响血小板的活化功能,而对血小板凋亡的诱导作用较弱,其次,ox-LDL与血小板共孵育后,血小板内p-AKt蛋白表达增加,提示ox-LDL可能通过PI3k/AKt信号通路,增加AKt磷酸化来促进血小板活化。ox-LDL可能通过促进血小板活化,在动脉粥样硬化血栓形成中发挥重要作用。