番茄SlNAM1转录因子的分离与功能分析

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低温是植物地理分布和农业生产的重要限制因素,低温胁迫包括冷害(<10°C)和冻害(<0°C)两种。低温能够直接抑制植物正常的生理代谢,造成植物生长发育的延缓或阻滞;低温导致光合速率下降,光合作用产物的形成、分配及转运均受到影响;低温会抑制水分的吸收,诱导产生次生的脱水和渗透胁迫;同时,低温还会诱导产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),对生物大分子及细胞膜结构造成破坏。番茄等喜温蔬菜经历低温时,自身不能完成冷驯化(Cold acclimation),因此其农业生产易受低温的影响。NAC转录因子是植物特有的转录因子家族。大多数NAC转录因子都是诱导表达型的,在植物不同发育阶段以及非生物胁迫和生物胁迫的响应过程中均发挥重要作用。番茄中的NAC转录因子多达102个,但功能大部分是未知的。本实验从番茄中分离得到了一个NAC转录因子(SlNAM1),并以过表达SlNAM1的转基因烟草为材料,研究了SlNAM1对烟草低温抗性的影响,对于阐明NAC转录因子参与植物低温响应的机制具有十分重要的科学意义。本研究主要结果如下:(1)根据NCBI中已知的SlNAM1基因序列(GenBank注册号:NM001247290),利用DNAMAN设计特异引物,以番茄cDNA为模板,利用PCR反应获得SlNAM1全长。SlNAM1基因全长1218bp,开放阅读框长891bp,编码296个氨基酸。(2)在烟草中瞬时表达和稳定表达SlNAM1-GFP融合蛋白产物,并利用激光共聚焦显微镜和荧光显微镜进行观察,发现绿色荧光只存在于细胞核中,说明SlNAM1定位于细胞核;利用酵母双杂交系统检测SlNAM1的转录激活活性,发现其C端具有转录激活活性,说明SlNAM1作为转录因子行使功能。(3)通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对SlNAM1在番茄中的表达模式进行了分析,发现该基因表达受4°C、PEG、NaCl、ABA和MeJA等多种胁迫和激素处理的诱导;组织特异性表达分析结果表明SlNAM1在叶片中表达量最高。(4)构建pBI121-SlNAM1真核表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得过表达SlNAM1的转基因烟草,利用PCR、qRT-PCR筛选得到转基因烟草,并选取OE-7、OE-10和OE-10进行后续实验。(5)正常条件下,转基因烟草与野生型烟草生长情况一致,并能正常的开花结籽。低温胁迫下,与野生型烟草相比,转基因烟草具有更高的种子萌发率、较低的失水萎蔫程度和更高的净光合速率。(6)低温胁迫下,烟草体内的活性氧积累急剧上升。与野生型烟草相比,转基因植株活性氧积累量明显较低,SOD和APX等抗氧化酶活性均高于野生型烟草;利用qRT-PCR对抗氧化酶合成关键基因的表达量进行分析,发现低温胁迫下转基因植株中的抗氧化酶表达量上调程度高于野生型,因此,我们认为转基因烟草通过上调抗氧化酶的合成来维持较高的抗氧化酶活性。同时,低温胁迫下,烟草中MDA含量和REL上升,细胞膜稳定性下降。与野生型烟草相比,转基因烟草的MDA含量和REL水平明显低于野生型,说明其细胞膜受伤害程度较轻。(7)低温胁迫下,转基因烟草中P5CS、DREB1和ERD10s等胁迫相关基因上调程度明显高于野生型。同时,转基因烟草中脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质含量增加,且明显高于野生型,这有利于维持细胞渗透势和内环境的稳态,缓解低温诱导产生的渗透胁迫,维持细胞膜的稳定性,提高转基因烟草的低温抗性。
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