【摘 要】
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Laceyella sacchari FBKL4.010归属于高温放线菌科（Thermoactinomycetacea e）、莱斯氏菌属（Laceyella sp.）下的糖莱斯氏菌（Laceyella sacchari）,前期研究表明,其在固态发酵条件下具有产四甲基吡嗪的能力,但并未对其发酵特性进行研究,此外Laceyella sacchari FBKL4.010产四甲基吡嗪的分子机制也并不明晰。
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Laceyella sacchari FBKL4.010归属于高温放线菌科（Thermoactinomycetacea e）、莱斯氏菌属（Laceyella sp.）下的糖莱斯氏菌（Laceyella sacchari）,前期研究表明,其在固态发酵条件下具有产四甲基吡嗪的能力,但并未对其发酵特性进行研究,此外Laceyella sacchari FBKL4.010产四甲基吡嗪的分子机制也并不明晰。本课题首先研究固态和液态发酵条件下Laceyella sacchari FBKL4.010的发酵特性,之后通过转录组测序技术揭示了液态发酵条件下Laceyella sacchari FBKL4.010产四甲基吡嗪过程中相关基因的表达情况,并筛选出与四甲基吡嗪合成相关的候选基因,最后探究外源添加物对Laceyella sacchari FBKL4.010的代谢调控作用。主要研究成果如下:1.固态发酵过程中,基质外观随着发酵时间的延长而逐渐呈现褐色,气味也逐渐浓郁。水分含量变化呈逐渐下降趋势,酸度呈逐渐上升趋势,而氨基酸态氮含量、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、糖化力和液化力的变化均呈先上升后下降的趋势。固态发酵条件下共检出51种挥发性成分,主成分分析显示各发酵阶段挥发性成分的种类和含量差异较大,在发酵前中期,挥发性成分主要为酮类和醇类,而发酵后期以醛类、酸类和吡嗪类为主。2.扫描电镜结果显示菌株在液态发酵基质中生长状态良好,菌丝体无明显附着物、孢子和孢子丝结构立体,菌丝体平均直径为0.42±0.11μm,展现了菌株生长良好的形态结构。理化指标结果显示菌体在液态发酵培养基中能进行生长代谢,并且具备产四甲基吡嗪的能力。液态发酵过程中共检出27种挥发性成分,主要有酮类、醛类、醇类、酸类、酯类、吡嗪类和烷烃类。发酵前中期主以醇类、酯类和烷烃类为主,在发酵中后期主要是酮类、醛类、酸类和吡嗪类物质。3.对液态发酵条件下的Laceyella sacchari FBKL4.010进行转录组测序,并对测定结果进行差异表达分析。共筛选到差异表达基因1284个,其中显著上调差异基因808个,显著下调差异基因476个。GO功能富集分析显示,差异基因主要富集在生物过程中的细胞过程（GO:0009987）、代谢过程（GO:0008152）和单生物过程（GO:0044699）;细胞组分中,主要富集在细胞（GO:0005623）、细胞部分（GO:0044464）和细胞膜（GO:0016020）;分子功能中,主要富集在催化活性（GO:0003824）、结合（GO:0005488）和转运活性（GO:0005215）。KEGG代谢途径富集分析显示,差异基因主要富集在氨基酸代谢、能量代谢和碳代谢等途径。4.结合结合相关文献,从差异表达基因中初步筛选与四甲基吡嗪合成相关的基因,其中10个显著上调差异基因和20个显著下调差异基因。主要涉及氨基酸代谢、碳代谢、柠檬酸循环、嘌呤代谢、嘧啶代谢、丁酸代谢和丙酮酸代谢等途径。从筛选出的30个差异表达的候选基因中,随机选取7个基因（roc F、roc G、pck A、lsp A、ack A、ilv B、ilv N）进行荧光定量PCR验证,结果表明各基因的表达趋势与转录组测序的结果基本一致,但差异倍数存在些许差异,这可能与菌株活力、RNA降解、仪器灵敏度等不同有关。5.代谢调控实验表明,外源添加乙酸钠不利于Laceyella sacchari FBKL4.010生物量的积累,此外,适宜浓度的乙酸钠对体系中乙酸生成有一定的负面影响。荧光定量PCR测定结果表明,不同浓度的乙酸钠会影响Laceyella sacchari FBKL4.010乙酸激酶基因ack A的表达量,Pearson相关性分析进一步验证了上述实验结果。摇瓶发酵实验结果表明,外源添加物乙酸钠（3.6 g/L）对体系中乙偶姻的积累有显著影响（p＜0.05）,但对四甲基吡嗪含量的影响较小（p＞0.05）。
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