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辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)是一种普遍存在的土壤兼性寄生菌,在世界范围内广泛引起辣椒疫病,是严重危害辣椒生产的重要病原之一。世界上种植辣椒的地区,由于辣椒疫病的发生严重影响了辣椒的产量和质量,造成了巨大的经济损失,对环境也造成了一定的影响。近年来,辣椒生产国开展了许多关于抗疫病育种和抗病性分析的研究,对抗病性生理生化机制,抗病性遗传,抗病基因的定位与克隆以及抗病性鉴定和抗病育种方面进行了大量研究但是进展缓慢。目前辣椒疫霉的防治还是以化学药剂防治为主,农药残留等问题仍然给辣椒生产、人类健康和环境安全带来了巨大威胁。因此,寻找探索辣椒疫霉菌重要的致病因子及其致病机制成为人们研究的重点。研究表明,在植物病原菌与寄主互作过程中,大多数植物病原会产生一系列调控植物生化、生理、形态学特征的效应分子来侵染寄主或调节植物的防卫反应。皱缩坏死(CRN)蛋白就是一类效应分子——胞质效应蛋白,在病原菌与寄主互作过程中通过附着胞和吸器等特殊的结构进入植物活细胞,调节植物的防卫反应。皱缩坏死(CRN)基因是Torto等人于2003年首次在马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)胞外蛋白cDNA数据库中发现的,其在农杆菌介导的瞬时表达体系中导致本氏烟产生皱缩坏死(crinkling and necrosis)的症状反应。CRN效应蛋白做为一类新的效应蛋白,目前只是在疫霉中发现了这类基因,对这类基因的研究还不多。在寄主与病原菌互作过程中,皱缩坏死蛋白的致病机制、进入细胞机制、作用靶标等都不清楚,所以成为人们研究的热点。本研究以实验室保存的高致病性辣椒疫霉菌株SD33为实验材料,对辣椒疫霉中的皱缩坏死基因进行了以下研究:(1)根据文献中报道的CRN基因的保守序列,我们从辣椒疫霉基因组全序列中筛选CRN-like序列,然后再NCBI-BLAST在线比对,确认筛选的基因属于CRN基因家族;(2)从本实验室保存的高致病性辣椒疫霉菌株基因组中,成功克隆了两个CRN基因,PcCRN1和PcCRN2,并在线比对和进行生物信息学分析;(3)为了了解PcCRN1和PcCRN2在辣椒疫霉菌中的致病性和保守序列LQLFLAK和WL在致病中的作用,对两个基因的保守位点进行突变,利用pGR106构建PcCRN1和PcCRN2及保守位点突变基因的PVX表达载体,通过农杆菌介导的瞬时表达进行体外功能检测;PcCRN1和PcCRN2在农杆菌中瞬时表达后均可产生褪绿症状;这两个基因保守位点突变前后在本氏烟中瞬时表达也均有差异,说明PcCRN1和PcCRN2在辣椒疫霉菌中起作用,保守位点的突变对其致病性也有影响;(4)利用pHam34载体构建PcCRN1和PcCRN2全长基因的沉默载体,通过PEG介导的原生质体共转化技术获得PcCRN1和PcCRN2基因沉默的转化子,通过RT-PCR和qRT-PCR技术检验并接种验证辣椒疫霉中CRN的功能。通过本研究,我们可以看出CRN基因在辣椒疫霉菌的致病过程中起作用,沉默转化子的成功筛选也证明了PEG介导的原生质体共转化技术在P. capsici中可以实施,为辣椒疫霉的分子致病机制研究提供了一种分子生物学技术。