前言及目的：　　食管癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，它有两种主要的组织学类型，即食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EA)，前者是东方国家食管癌的主要组织学类型，在我国约占食管癌总数的90％。目前已明确，酒精和烟草是食管鳞状细胞癌发生的主要风险因素，它们引起鳞癌发生的机制主要与乙醇的代谢产物（乙醛和乙酸等）以及烟雾中的多环芳烃和亚硝酸盐有关。这些因素在食管组织中产生细胞因子、前列腺素和活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，损伤生物大分子，引起癌基因的激活和抑癌基因的失活，最后通过创造局部微环境促进肿瘤的形成，加速肿瘤的演进。　　在ROS等损伤因素的作用下，细胞DNA的碱基遭到破坏，产生无嘌呤无嘧啶位点（apurinic/apyrimidinic site，AP位点），AP位点的存在将阻碍DNA合成、导致基因不稳定或变异。在这种情况下，宿主的反应之一是诱导DNA修复酶的产生，如无嘌呤无嘧啶核酸内切酶-1（apurinic/apyrimidinic endonuclease-1，APE-1），由于它同时具有氧化还原调节功能，因此常用APE/Ref-1代表其双功能特点。APE/Ref-1是负责DNA碱基切除修复(base excision repair, BER)过程、维护基因稳定的一个关键酶。它的表达不仅与肿瘤的形成有关，而且与肿瘤的放化疗敏感性有关，如果APE/Ref-1的活性下降，引起BER机制减弱，机体对放化疗的敏感性将会增加，近年来APE/Ref-1抑制剂与放化疗联合应用在抗肿瘤的试验中显示良好的前景。以往的研究证实，在胃癌细胞系中幽门螺杆菌(H.pylori)感染可诱导APE/Ref-1的表达，而且APE/Ref-1在头颈癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌等恶性肿瘤中的表达已有报道，然而迄今为止在食管癌，特别是食管鳞状细胞癌组织中尚无APE/Ref-1表达的相关报道。　　核因子-κB(nuclear factorκB，NF-κB)信号通路参与对细胞增生、存活和血管生成等活动的调控，并与许多恶性肿瘤的发生和发展有关，研究表明，NF-κB在食管癌的发生、发展中发挥重要的作用。以往的研究认为，抑制性κB的降解是NF-κB激活的主要途径，近年来研究表明，NF-κB-p65的磷酸化是NF-κB激活的第二条途径，另有研究证实细胞核定位的NF-κB-p65可作为食管癌组织中监测NF-κB活性的一个重要指标。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractantprotein-1，MCP-1)又称CCL2，是C-C趋化因子家族的成员之一，肿瘤细胞中的MCP-1表达与巨噬细胞浸润以及肿瘤的演进有关，研究证实它能激活NF-κB信号通路。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是前列腺素生成过程中的关键酶，它与肿瘤的发生、发展、凋亡、血管生成和转移等过程密切相关，最近研究发现它能影响APE/Ref-1的表达。　　本研究首先通过免疫组织化学染色分析，研究APE/Ref-1在食管鳞状细胞癌组织中的表达特点和影响因素;然后通过在食管鳞状细胞癌细胞系KYSE220中研究APE/Ref-1表达与NF-κB-p65以及MCP-1和COX-2的关系，确定APE/Ref-1表达的调控机制，从而为食管鳞状细胞癌的治疗提供潜在的靶点。　　材料和方法：　　67例食管鳞状细胞癌和10例相应的癌旁石蜡包埋组织来自日本医科大学附属病院的手术患者，所有患者术前均未接受化疗和放疗，本研究得到患者和伦理委员会的书面同意。人食管鳞状细胞癌细胞系KYSE220购自日本国家生物医学研究所。　　APE/Ref-1兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，MCP-1和NF-κB-p65兔抗人多克隆抗体购自美国Abcam公司，NF-κB-p65鼠抗人单克隆抗体购自美国Abcam公司，COX-2鼠抗人单克隆抗体购自美国Cayman公司，COX-2兔抗人多克隆抗体购自日本IBL公司;山羊抗兔TRITC和山羊抗鼠FITC购自美国EarthOx公司。人重组MCP-1购自美国BD Pharmingen公司;蛋白酶体抑制剂MG-132购自美国Calbiochem公司;COX-2抑制剂NS-398购自美国Sigma公司;APE/Ref-1的Real-time PCR引物、探针购自美国Applied Biosystems公司;NF-κB-p65 siRNA购自美国Invitrogen公司。　　CX-31光学显微镜和BX-51免疫荧光显微镜，日本Olympus公司;MCO-18AIC细胞培养箱，日本Sanyo公司;5810R低温超速离心机，德国Eppendorf公司;MDF-U32V冰箱，日本Sanyo公司;蛋白电泳仪及转膜仪，美国Bio-rad公司;凝胶自动成像分析系统，英国GE Healthcare公司;7500快速Real-time PCR仪，美国Applied Biosystems公司。　　采用免疫组织化学技术分析食管鳞状细胞癌组织中APE/Ref-1、MCP-1、NF-κB-p65和COX-2的表达;采用连续切片染色和免疫荧光双重染色技术观察食管鳞状细胞癌组织中APE/Ref-1与NF-κB-p65的共同表达状态;采用Real-timePCR技术分析食管鳞状细胞癌细胞系KYSE220细胞中APE/Ref-1 mRNA的表达;采用Western blotting技术分析KYSE220细胞中AP E/Ref-1、COX-2和NF-κB-p65蛋白的表达;采用siRNA技术沉默KYSE220细胞中NF-κB-p65的表达。　　两组等级或计量资料之间比较采用Mann-WhitneyU检验，多组计量资料之间比较采用单因素方差分析;APE/Ref-1与影响因素之间的相关性采用Spearman秩相关检验或Log rank趋势检验。结果表示为:平均值±SD，p＜.05认为具有统计学差异。分析过程采用SPSS11.5软件进行统计学处理。　　结果：　　1、食管鳞状细胞癌和癌旁组织中APE/Ref-1的表达　　在食管鳞状细胞癌石蜡包埋组织中(n=67)，APE/Ref-1细胞核表达占89.6％(60/67)，APE/Ref-1染色阳性细胞的百分率:73.32±15.34％;　　在相应的癌旁组织中(n=10)，APE/Ref-1全部位于细胞核，APE/Ref-1染色阳性细胞的百分率:12.87±3.52％;　　食管鳞状细胞癌组织中APE/Ref-1染色阳性细胞的百分率显著高于癌旁组织(p＜0.001)。　　2、食管鳞状细胞癌组织中MCP-1、COX-2和NF-κB-p65的表达　　MCP-1和COX-2均在细胞浆中表达;MCP-1染色阳性组织占79.1％(53/67)，染色评分平均为0.8;COX-2染色阳性组织占94.0％(63/67)，染色评分平均为:2.2;　　NF-κB-p65在细胞浆和细胞核中表达，细胞浆染色阳性组织占100％(67/67)，染色评分平均为:2.0;细胞核染色阳性组织占80.6％(54/67)，染色评分平均为:1.4。　　将所有食管鳞状细胞癌组织按MCP-1的表达分组，MCP-1阳性组APE/Ref-1、细胞浆NF-κB-p65、COX-2均较MCP-1阴性组显著升高(p＜0.001;p=0.008;p＜0.001)，而细胞核NF-κB-p65无显著差异(p＞0.05）。　　3、食管鳞状细胞癌组织中APE/Ref-1和NF-κB-p65的共同表达　　连续切片免疫染色提示，APE/Ref-1和细胞浆NF-κB-p65在食管鳞状细胞癌癌细胞中共同表达;免疫荧光双重染色提示，APE/Ref-1和细胞核NF-κB-p65在食管鳞状细胞癌癌细胞中共同表达。　　4、食管鳞状细胞癌组织中APE/Ref-1表达的影响因素　　Spearman秩相关检验提示:APE/Ref-1的表达与MCP-1、细胞浆NF-κB-p65和COX-2显著相关(p＜0.001;p=0.017;p＜0.001)，而与细胞核NF-κB-p65无相关（p＞0.05）。　　Log rank趋势检验提示:APE/Ref-1的表达与肿瘤的浸润深度(T)、区域淋巴结转移(N)、远处转移(M)、TNM分期和性别显著相关(p=0.011;p=0.007; p=0.003;p=0.001;p=0.04)，而与年龄和肿瘤分化程度无关(p＞0.05;p＞0.05)。　　5、MCP-1对食管鳞状细胞癌细胞系KYSE220细胞NF-κB-p65表达的影响　　MCP-1（3-100pg/mL）呈剂量依赖的方式诱导NF-κB-p65总蛋白和NF-κB-p65细胞核蛋白的表达。　　6、MCP-1和MG-132对食管鳞状细胞癌细胞系KYSE220细胞APE/Ref-1表达的影响　　MCP-1(100pg/mL)能显著诱导APE/Ref-1蛋白和APE/Ref-1 mRNA的表达(所有p＜0.001)，而MG-132预先处理(1μmol/L)能显著抑制MCP-1的诱导效应(所有p＜0.01)。　　7、MCP-1和MG-132对食管鳞状细胞癌细胞系KYSE220细胞COX-2表达的影响　　MCP-1(100pg/mL)能显著诱导COX-2蛋白的表达(p＜0.001)，而MG-132预先处理(1μmol/L)不能显著抑制MCP-1的诱导效应(p＞0.05）。　　8、MCP-1和NS-398对食管鳞状细胞癌细胞系KYSE220细胞NF-κB-p65和APE/Ref-1表达的影响　　MCP-1(100pg/mL)能显著诱导NF-κB-p65总蛋白、NF-κB-p65细胞核蛋白以及APE/Ref-1蛋白和APE/Ref-1 mRNA的表达(p＜0.01;p＜0.001;p＜0.01;p＜0.001)，而NS-398(10μmol/L)能显著抑制MCP-1的诱导效应(p＜0.01;p＜0.05;p＜0.05;p＜0.01)。　　9、NF-κB-p65 siRNA对食管鳞状细胞癌细胞系KYSE220细胞APE/Ref-1和COX-2表达的影响　　10nM和20nM的NF-κB-p65 siRNA能显著下调APE/Ref-1蛋白和APE/Ref-1mRNA的表达(所有p＜0.001)，但对COX-2蛋白的表达无显著影响(所有p＞0.05)。　　结论：　　1、在食管鳞状细胞癌组织中，APE/Ref-1的过度表达参与肿瘤的发生和发展过程。　　2、在食管鳞状细胞癌细胞系中，APE/Ref-1的表达受NF-κB信号通路的调控，NF-κB-p65在APE/Ref-1的调控中发挥重要的作用。　　3、在食管鳞状细胞癌细胞系中，COX-2通路介导MCP-1对NF-κB信号通路的激活过程。　　4、在食管鳞状细胞癌细胞系中，MCP-1和COX-2参与调控APE/Ref-1盼表达。