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BPs是近20年来发展起来的抗代谢性骨病的一类新药，临床上主要用于治疗骨质疏松症、变形性骨炎、恶性肿瘤骨转移引起的高钙血症和骨痛症等。
由于BPs具有极性强、易电离、大部分无生色团、不挥发、生物利用度低等性质，给该类药物的分析带来一定的困难。目前，在该类药物的质量控制中仍然采用钼蓝比色法，该方法是将BPs氧化成正磷酸盐后，进行磷钼蓝比色，其有关物质（磷酸盐、亚磷酸盐）及还原性辅料对测定结果均有影响，专属性差。虽然已有文献报道专属的HPLC-ELSD方法，但其灵敏度仍然较低，仅适用于该类药物的原料药或制剂的分析，不能满足生物样品中痕量BPs检测的要求。少数含伯胺基的BPs，如Alen、Pami等，通过对其氨基衍生，进行色谱分析，提高了灵敏度，能够满足痕量生物样品分析的要求。但这些方法不适合绝大多数不含衍生基团的BPs，且操作繁琐、费时。
本文课题的目的是建立专属的、灵敏的BPs分析方法，为该类药物的质量控制提供可靠的、更完善的分析手段。本课题主要从以下两个部分进行了研究：
第一部分新型OPM的形成及其在药物分析中的应用
一、新型OPM的形成机理及性质的研究
目的：研究新型OPM的形成机理及其性质，如配比、摩尔吸收系数等。
方法：酸性条件下，BPs与MoO反应生成具有较强紫外吸收的OPM；采用紫外分光光度计扫描，确定最大吸收处波长；采用Job法和平行移动法确定OPM分子结构中BPs和Mo的配比。
结果：新型OPM较稳定；OPM分子结构中BPs和Mo的配比均为1：5，Alen，Pami，Zole，Eti，Inca和Iban与MoO形成的OPM的摩尔吸收系数分别为8.61×103、9.58×103、6.89×103、7.53×103、8.08×103、8.80×103（L·mol-1·cm-1）。不论BPs分子结构中是否含有氨基，BPs与MoO在酸性条件下反应均能形成OPM.
结论：在酸性条件下，BPs与MoO反应生成稳定的、强紫外吸收的络合物-OPM。OPM分子的中心原子是有机膦原子。
二、基于新型OPM的分光光度法在BPs制剂分析中应用
目的：建立灵敏的、专属的分光光度法，分析制剂中BPs含量和小剂量伊班膦酸钠片剂的溶出度。
方法：依据BPs和MoO在酸性条件下反应生成的OPM具有较强紫外吸收的性质，采用紫外分光光度法，检测波长为254nm。
结果：OPM较稳定，室温放置24h最大吸收强度没有变化；以试剂空白为参比，OPM在254nm处的吸收强度与BPs浓度成良好的线性关系，Alen、Pami、Zole、Eti、Inca和Iban线性范围分别为5.00～50.0、4.92～49.2、5.26～52.6、5.00～50.0、5.16～51.6、4.92～49.2μg·ml-1（r≥0.9989），检测限分别为0.677、0.916、0.710、0.607、0，810、0.781μg·mL-1，定量限分别为0.203、0.275、0.213、0.182、0.243、0.234μg·mL-1，平均回收率为96.8～102.6％（n=3），RSD小于1.5％； Iban片剂在8分钟时溶出度达到86％，10分钟时基本完全溶出。
结论：该方法专属性好、灵敏度高、简便快速，适用于BPs制剂的分析和小剂量Iban片剂溶出度的分析。该方法与传统的磷钼蓝比色法相比较，不但不受磷酸盐、亚磷酸盐和还原性辅料的干扰，而且简便快速，不需要复杂的样品预处理。
第二部分 BPs的色谱分析方法的应用研究
一、CE-间接紫外检测法测定Eti和Iban片剂含量
目的：建立简便、快速、经济的CE-间接紫外检测方法，用于Eti和Iban的制剂分析。
方法：以未涂层熔融石英毛细管柱为分离通道；背景电解质为7mmol·L-1苯甲酸钠溶液；运行缓冲溶液为7mmol·L-1磷酸二氢钾（pH8.0）；分离电压为20kV；进样电压为10kV，进样时间为5s；检测波长为224nm。
结果：Eti和Iban在62.60～1002μg·mL-1和61.00～975μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好（r均大于0.999），检测限分别为7.825μg·mL-1和7.744μg·mL-1，平均回收率在99.5％～100.3％之间，RSD小于1.5％（n=3）。
结论：采用CE-间接紫外分离检测Eti和Iban的方法简便、快速、经济，适用于Eti和Iban制剂的常规分析，为该药物的质量控制提供了一个新的、专属的、灵敏的分析方法。
二、离子对RP-HPLC-ELSD法测定Iban制剂的含量
目的：建立专属的、灵敏的分析Iban制剂含量的离子对RP-HPLC-ELSD方法。
方法：以UltimateTM XB-C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱为固定相，流动相为20mM三乙胺（用冰醋酸调pH至8.5）-甲醇-乙腈（90：2：8），流速为1.0ml·L-1，柱温为室温，检测器为ELSD。
结果：Iban在30.70～980.0μg·L-1的浓度范围内线性关系良好，回归方程为lgA=1.060 lgC+2.047（r=0.999），最低检测限为7.675μg·mL-1，平均回收率为98.9～100.5％，RSD小于1.1％。
结论：本文建立的RP-HPLC-ELSD方法专属性好、灵敏度高。与文献报道的RP-HPLC-ELSD方法相比较，由于采用了分子量小、挥发性更强的三乙胺作为离子对试剂，提高了检测灵敏度，为Iban的生产及制剂过程中的质量控制提供了可靠的分析手段。
三、在线柱后光化学反应离子对RP-HPLC-UV法测定Zole制剂的含量
目的：建立灵敏的、专属的在线柱后光化学衍生离子对RP-HPLC-UV法测定Zole制剂含量的方法。
方法：以Phenomenon C18色谱柱为固定相，流动相为三乙胺（20mM用冰醋酸调pH为7.0）-甲醇（99：1），流速为1mL·min-1，柱温为室温。色谱流出液与过硫酸钾混合后流经一聚四氟乙烯盘管制成的光化学反应器时，Zole被氧化成正磷酸盐，正磷酸盐再与MoO、维生素C反应生成磷钼杂多络合物，用紫外-可见检测器检测，检测波长为650nm。
结果：实现了Zole及其有关物质（磷酸盐和亚磷酸盐）分离和检测。Zole在20.00～250.0μg·mL-1浓度范围内线性关系良好（r=0.999），检测限为1μg·mL-1。对于注射用Zole的平均回收率为98.7～101.0％，RSD小于2.1％，对于Zole注射液回收率为99.6～100.4％，RSD小于1.6％。
结论：本文建立的离子对RP-HPLC-UV专属性好、灵敏度高、分析速度快，不需要繁琐的样品预处理过程，适用于Zole制剂的分析，为该药物制剂的常规的分析及质量控制提供了有效地可靠的分析手段。
由于BPs具有极性强、易电离、大部分无生色团、不挥发、生物利用度低等性质，给该类药物的分析带来一定的困难。目前，在该类药物的质量控制中仍然采用钼蓝比色法，该方法是将BPs氧化成正磷酸盐后，进行磷钼蓝比色，其有关物质（磷酸盐、亚磷酸盐）及还原性辅料对测定结果均有影响，专属性差。虽然已有文献报道专属的HPLC-ELSD方法，但其灵敏度仍然较低，仅适用于该类药物的原料药或制剂的分析，不能满足生物样品中痕量BPs检测的要求。少数含伯胺基的BPs，如Alen、Pami等，通过对其氨基衍生，进行色谱分析，提高了灵敏度，能够满足痕量生物样品分析的要求。但这些方法不适合绝大多数不含衍生基团的BPs，且操作繁琐、费时。
本文课题的目的是建立专属的、灵敏的BPs分析方法，为该类药物的质量控制提供可靠的、更完善的分析手段。本课题主要从以下两个部分进行了研究：
第一部分新型OPM的形成及其在药物分析中的应用
一、新型OPM的形成机理及性质的研究
目的：研究新型OPM的形成机理及其性质，如配比、摩尔吸收系数等。
方法：酸性条件下，BPs与MoO反应生成具有较强紫外吸收的OPM；采用紫外分光光度计扫描，确定最大吸收处波长；采用Job法和平行移动法确定OPM分子结构中BPs和Mo的配比。
结果：新型OPM较稳定；OPM分子结构中BPs和Mo的配比均为1：5，Alen，Pami，Zole，Eti，Inca和Iban与MoO形成的OPM的摩尔吸收系数分别为8.61×103、9.58×103、6.89×103、7.53×103、8.08×103、8.80×103（L·mol-1·cm-1）。不论BPs分子结构中是否含有氨基，BPs与MoO在酸性条件下反应均能形成OPM.
结论：在酸性条件下，BPs与MoO反应生成稳定的、强紫外吸收的络合物-OPM。OPM分子的中心原子是有机膦原子。
二、基于新型OPM的分光光度法在BPs制剂分析中应用
目的：建立灵敏的、专属的分光光度法，分析制剂中BPs含量和小剂量伊班膦酸钠片剂的溶出度。
方法：依据BPs和MoO在酸性条件下反应生成的OPM具有较强紫外吸收的性质，采用紫外分光光度法，检测波长为254nm。
结果：OPM较稳定，室温放置24h最大吸收强度没有变化；以试剂空白为参比，OPM在254nm处的吸收强度与BPs浓度成良好的线性关系，Alen、Pami、Zole、Eti、Inca和Iban线性范围分别为5.00～50.0、4.92～49.2、5.26～52.6、5.00～50.0、5.16～51.6、4.92～49.2μg·ml-1（r≥0.9989），检测限分别为0.677、0.916、0.710、0.607、0，810、0.781μg·mL-1，定量限分别为0.203、0.275、0.213、0.182、0.243、0.234μg·mL-1，平均回收率为96.8～102.6％（n=3），RSD小于1.5％； Iban片剂在8分钟时溶出度达到86％，10分钟时基本完全溶出。
结论：该方法专属性好、灵敏度高、简便快速，适用于BPs制剂的分析和小剂量Iban片剂溶出度的分析。该方法与传统的磷钼蓝比色法相比较，不但不受磷酸盐、亚磷酸盐和还原性辅料的干扰，而且简便快速，不需要复杂的样品预处理。
第二部分 BPs的色谱分析方法的应用研究
一、CE-间接紫外检测法测定Eti和Iban片剂含量
目的：建立简便、快速、经济的CE-间接紫外检测方法，用于Eti和Iban的制剂分析。
方法：以未涂层熔融石英毛细管柱为分离通道；背景电解质为7mmol·L-1苯甲酸钠溶液；运行缓冲溶液为7mmol·L-1磷酸二氢钾（pH8.0）；分离电压为20kV；进样电压为10kV，进样时间为5s；检测波长为224nm。
结果：Eti和Iban在62.60～1002μg·mL-1和61.00～975μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好（r均大于0.999），检测限分别为7.825μg·mL-1和7.744μg·mL-1，平均回收率在99.5％～100.3％之间，RSD小于1.5％（n=3）。
结论：采用CE-间接紫外分离检测Eti和Iban的方法简便、快速、经济，适用于Eti和Iban制剂的常规分析，为该药物的质量控制提供了一个新的、专属的、灵敏的分析方法。
二、离子对RP-HPLC-ELSD法测定Iban制剂的含量
目的：建立专属的、灵敏的分析Iban制剂含量的离子对RP-HPLC-ELSD方法。
方法：以UltimateTM XB-C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱为固定相，流动相为20mM三乙胺（用冰醋酸调pH至8.5）-甲醇-乙腈（90：2：8），流速为1.0ml·L-1，柱温为室温，检测器为ELSD。
结果：Iban在30.70～980.0μg·L-1的浓度范围内线性关系良好，回归方程为lgA=1.060 lgC+2.047（r=0.999），最低检测限为7.675μg·mL-1，平均回收率为98.9～100.5％，RSD小于1.1％。
结论：本文建立的RP-HPLC-ELSD方法专属性好、灵敏度高。与文献报道的RP-HPLC-ELSD方法相比较，由于采用了分子量小、挥发性更强的三乙胺作为离子对试剂，提高了检测灵敏度，为Iban的生产及制剂过程中的质量控制提供了可靠的分析手段。
三、在线柱后光化学反应离子对RP-HPLC-UV法测定Zole制剂的含量
目的：建立灵敏的、专属的在线柱后光化学衍生离子对RP-HPLC-UV法测定Zole制剂含量的方法。
方法：以Phenomenon C18色谱柱为固定相，流动相为三乙胺（20mM用冰醋酸调pH为7.0）-甲醇（99：1），流速为1mL·min-1，柱温为室温。色谱流出液与过硫酸钾混合后流经一聚四氟乙烯盘管制成的光化学反应器时，Zole被氧化成正磷酸盐，正磷酸盐再与MoO、维生素C反应生成磷钼杂多络合物，用紫外-可见检测器检测，检测波长为650nm。
结果：实现了Zole及其有关物质（磷酸盐和亚磷酸盐）分离和检测。Zole在20.00～250.0μg·mL-1浓度范围内线性关系良好（r=0.999），检测限为1μg·mL-1。对于注射用Zole的平均回收率为98.7～101.0％，RSD小于2.1％，对于Zole注射液回收率为99.6～100.4％，RSD小于1.6％。
结论：本文建立的离子对RP-HPLC-UV专属性好、灵敏度高、分析速度快，不需要繁琐的样品预处理过程，适用于Zole制剂的分析，为该药物制剂的常规的分析及质量控制提供了有效地可靠的分析手段。