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目的以体外培养神经元建立细胞应激模型,从细胞水平探讨EGCG对应激性损伤神经元中相关信号转导蛋白表达变化的干预作用,其中重点检测ERK1/2、PI3K/Akt等信号蛋白的磷酸化及基因表达情况,以阐明EGCG对应激性神经损伤保护作用的具体机制,确定EGCG对中枢神经系统作用的靶分子,从而为以天然活性物质EGCG作为应激损伤防护措施的研究奠定基础。方法1采用新生24h内的wistar大鼠原代培养海马神经元,用细胞免疫荧光法鉴定神经元纯度。2采用western blot法检测原代培养神经元中糖皮质激素受体的表达。3采用CCK8法观察皮质酮诱导原代培养海马神经元的存活率,筛选建立体外应激细胞模型的皮质酮作用时间和浓度。4采用10μmol/L皮质酮,作用24h建立体外应激神经损伤细胞模型。将原代培养神经元分为空白对照组、应激损伤组、EGCG干预组,用CCK8法检测神经元存活率、形态学观察法和Hoechst33342法检测神经元形态学、坏死率、凋亡率的改变。筛选EGCG对应激神经元保护作用的浓度。5在EGCG预处理体外应激神经元模型中加入U0126(ERK1/2特异性阻断剂),LY294002(PI3K/Akt特异性阻断剂)两种信号通路特异性阻断剂,CCK8法检测细胞存活率的改变。6采用western blot法检测应激刺激后不同时间点、添加不同浓度EGCG后应激神经元中ERK1/2、PI3K/Akt等信号蛋白表达及其磷酸化水平的变化情况。7采用RT-PCR技术检测EGCG干预后应激神经元中ERK1/2、Akt等信号蛋白mRNA表达变化情况。结果1无血清体外培养神经元,神经元纯度>90%。2在体外培养13天,神经元中糖皮质激素受体成熟可用于应激神经元的造模。3皮质酮在1-100μml/L范围内对海马神经元的神经毒性作用呈现浓度-时间依赖性;10μmol/L皮质酮,作用24h能明显降低海马神经元存活率至75.23%,较正常组明显降低(P<0.05),且细胞坏死率及凋亡率增加,以此建立体外应激性神经损伤细胞模型。4 0.1-1μmol/LEGCG预处理,能显著降低应激诱导海马神经元的坏死与凋亡,提高应激性损伤神经元的存活率至93.37%、85.43%。5-10μmol/LEGCG预处理,海马神经元的存活率降低至65.97±%、58.47%,较正常组明显降低(P<0.05),且坏死、凋亡率增加。5加入PI3K/Akt特异性阻断剂LY294002(1Oμmol/L)能够抑制EGCG的保护作用,海马神经元细胞存活率降低至66.90%;加入ERK1/2特异性阻断剂U0126(10μmol/L)也对EGCG的作用产生了抑制,海马细胞存活率下降为62.54%,与正常对照组及EGCG组相比均有统计学意义(P<0.05)。6在应激神经元中,p-ERK1/2在皮质酮处理1h后降低,EGCG干预能激活p-ERK1/2,较应激组表达明显增加;在整个过程中ERKmRNA表达水平无显著变化。7在应激神经元中,p-Akt在皮质酮处理1h后降低,EGCG在低浓度(0.1-5μmol/L)时,能使p-Akt的表达增加,而EGCG在高浓度(10μmol/L)则使p-Akt的表达降低;EGCG能提高应激性损伤所致的AktmRNA表达降低。结论体外皮质酮应激海马神经元出现细胞存活率下降,细胞坏死率、凋亡率上升,而适宜浓度的EGCG干预可显著改善海马神经元的应激损伤。并且,EGCG干预可影响神经元中信号蛋白ERK1/2、Akt的磷酸化表达水平。这提示,EGCG对应激神经元的保护作用可能与其对信号转导通路MEK/ERK1/2、PI3K/Akt的调控有关。另外,EGCG对应激神经元具有双向调节作用,在较低浓度时,可发挥保护作用,而在高浓度时则促进神经元损伤。